轉基因番茄外源基因檢測方法研究.pdf

1、近年來，轉基因技術的發(fā)展引起了人們關注。轉基因技術為解決人類的食物短缺等問題帶來了福音，然而其引發(fā)的合理性和安全性問題亦成為關注的焦點。針對轉基因植株的安全性和合理性，建立健全轉基因作物的檢測方法體系顯得很迫切，尤其是探索一套經濟便捷的檢測體系更是當前科研工作的重點。自第一例轉基因植株培育成功以來，轉基因作物種類不斷增多，番茄作為世界性的蔬菜，針對其性狀和質量改良的轉基因品系也相繼商品化進入市場。我國是番茄進出口大國，所以針對轉基因番茄

2、建立一套番茄轉基因檢測方法體系是有必要的。
　　 本文以兩個陽性樣品華番一號和麗春番茄，陰性對照樣品合作903和一個購自市場的隨機抽檢樣品為檢測對象，分別采用傳統(tǒng)定性PCR技術、核酸斑點雜交以及微流體芯片技術，對上述樣品進行了檢測。檢測的外源基因選擇轉基因番茄中慣用的35S（花椰菜花葉病毒啟動子）、NOS（胭脂堿合成酶終止子），NPTⅡ(新霉素轉移酶基因)，35S-EFE(35S和番茄EFE基因的交聯(lián)結構)、內參基因選擇番茄La

3、t52（花藥特異表達啟動子），mcpi（金屬羧肽酶），fru（β-呋喃果糖苷酶），apx（抗壞血酸過氧化物酶）。
　　 研究中首先采用傳統(tǒng)定性PCR技術和核酸斑點雜交技術，檢測了外源基因35S、NOS、NPTⅡ、35S-EFE和內參Lat52基因。選用質粒PBI121為陽性對照、合作903番茄為陰性對照。華蕃一號樣品中4個外源基因和1個內參基因均成功檢出，陽性質粒PBI121中只有35S、NOS、NPTⅡ基因被檢出，陰性對照番茄

4、合作903中只有內參基因Lat52檢出。試驗重復性良好，檢測靈敏度高，兩種方法相互補充，排除假陽性可能。核酸斑點雜交一次可檢出多個外源基因，增加了檢測數(shù)量，為我國番茄轉基因檢測提供參考。
　　 其次本研究將普遍運用于基因表達譜分析等領域的微流體基因芯片技術運用于轉基因番茄檢測，搜索報道的轉基因番茄基因信息，設計了895條針對轉基因番茄的外源基因和內參基因的寡聚核苷酸探針，每條探針4個重復，原位合成轉基因番茄微流體檢測芯片。分別采

5、用普通PCR-CY3標記、（二次擴增）多重PCR-CY3標記和隨機引物-CY3標記三種CY3標記方案將熒光信號滲入番茄DNA，以華番一號為樣本進行芯片雜交檢測，比較了三種標記方案的標記效果。選取標記效果較好的普通PCR-CY3標記和多重PCR-CY3標記方法分別對陽性品種麗春番茄進行芯片檢測試驗。并用普通PCR-CY3標記的方法檢測了陰性番茄品種合作903以及隨機抽檢的市場品種黃色圣女果番茄。芯片檢測結果表明:普通PCR-CY3標記、（

6、二次擴增）多重PCR-CY3標記體系較適合芯片檢測樣品處理，而隨機引物標記方法沒得到較好的標記效果。從華番一號、麗春番茄樣品中檢出了35S啟動子、NOS終止子、35S-EFE交聯(lián)結構基因、NPTⅡ標記基因以及番茄的4個內參基因fru、apxmcpi、Lat52的多數(shù)探針信號，四次重復平均信號值良好，偏差小，信號值較高。合作903番茄的芯片上只有內參基因探針檢出信號，而圣女果番茄中不僅檢測到番茄內參基因探針信號，4個外源基因的探針均有探針