轉(zhuǎn)基因克隆牛外源基因整合位點(diǎn)及拷貝數(shù)研究.pdf

1、分類號(hào)：Q2墨密級(jí)：公玨轉(zhuǎn)基因克隆牛外源基因及拷貝數(shù)研究單位代碼：!QQ墨魚學(xué)號(hào)：上鯉9104整合位點(diǎn)芷口I旦J育～7一IntegrationSiteandCNumbelransgeneIntegrationSiteandopyNumberAnalysisinTtansgenicclonedBovine學(xué)位申請(qǐng)人：譚貝貝指導(dǎo)教師：李世杰教授學(xué)科專業(yè)：微生物與生化藥學(xué)學(xué)位類別：理學(xué)碩士授予單位：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)答辯日期：二。一二年五月二十六日

2、摘要轉(zhuǎn)基因克隆動(dòng)物是在獲得轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系的基礎(chǔ)上進(jìn)行體細(xì)胞克隆(體細(xì)胞核移植)，生產(chǎn)具有特定性狀、特殊功能或者一定目的的克隆動(dòng)物群。近十年來(lái)，轉(zhuǎn)基因技術(shù)與體細(xì)胞克隆技術(shù)的結(jié)合使轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的生產(chǎn)有了突飛猛進(jìn)的發(fā)展。轉(zhuǎn)基因克隆動(dòng)物在生產(chǎn)人類重要的醫(yī)藥蛋白、培育抗病品系、異種器官移植以及基因治療等方面都顯示出了廣闊的應(yīng)用前景。確定外源基因的整合位點(diǎn)及拷貝數(shù)是對(duì)外源基因下一步表型研究和整合機(jī)理探討的前提條件。本實(shí)驗(yàn)首先分析了轉(zhuǎn)人溶菌酶基因克隆牛中

3、外源基因的整合位點(diǎn)及拷貝數(shù)，并分析了轉(zhuǎn)基因個(gè)體整合位點(diǎn)的純合性。本實(shí)驗(yàn)得到結(jié)果如下：1應(yīng)用TAILPCR、DWACPPCR和旁側(cè)PCR方法得到了2頭轉(zhuǎn)基因克隆牛外源基因的整合位點(diǎn)，結(jié)果表明2個(gè)轉(zhuǎn)基因個(gè)體中外源基因均以單一位點(diǎn)形式整合在受體基因組上，得到兩個(gè)整合位點(diǎn)即4個(gè)結(jié)合片段。20504個(gè)體外源基因整合在牛的24號(hào)染色體的基因組克隆mw0031045661)中。外源基因整合造成染色體約238bp的核苷酸缺失，外源基因3’端有約3103

4、bp核苷酸的缺失且整合位點(diǎn)處富含AT序列。2個(gè)整合片段的末端與拓?fù)洚悩?gòu)酶I作用位點(diǎn)的共有序列相連。外源基因與染色體的整合連接處存在短的同源序列。3Yun個(gè)體中外源基因整合在牛的16號(hào)染色體的基因組克隆(NW0031044401)中，整合位點(diǎn)位于LOCl0030基因和RGLl基因之間。外源基因的整合造成染色體約228bp的核苷酸缺失，外源基因3’端同樣缺失約3103bp的核苷酸。整合位點(diǎn)連接處同樣導(dǎo)致個(gè)別堿基的缺失。2個(gè)整合片段的末端與拓

5、撲異構(gòu)酶I作用位點(diǎn)的共有序列相連。并且外源基因與染色體的整合連接處存在短的同源序列。4本實(shí)驗(yàn)以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參，采用絕對(duì)定量PCR法檢測(cè)外源基因拷貝數(shù)。標(biāo)準(zhǔn)曲線為：LogaN(拷貝數(shù))=03075△Ct07421(R2=09996，p0001)，計(jì)算得到4頭原代轉(zhuǎn)基因克隆牛外源基因拷貝數(shù)分別為1335883、1234408、1169825、10127，說(shuō)明外源基因基本以單拷貝形式整合到受體基因組上。5采用整合位點(diǎn)57上游和3’下游側(cè)