轉(zhuǎn)人α-乳清蛋白基因克隆牛中外源基因整合位點(diǎn)的檢測(cè)及分析.pdf

1、近些年來，轉(zhuǎn)基因技術(shù)和體細(xì)胞核移植技術(shù)(somatic cell nuclear transfer, SCNT)相結(jié)合使得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的生產(chǎn)效率有了很大的提高，然而外源基因整合到受體染色體上的整合機(jī)制還不是很清楚。本研究主要利用TAIL-PCR和Junction PCR等方法對(duì)5頭通過SCNT技術(shù)得到的轉(zhuǎn)基因克隆牛的整合位點(diǎn)進(jìn)行克隆，并對(duì)整合位點(diǎn)的特征進(jìn)行了分析，以期為揭示外源基因整合到受體染色體的機(jī)制提供依據(jù)。所得結(jié)果如下:
　　

2、1.應(yīng)用TAIL-PCR對(duì)5頭轉(zhuǎn)人α-乳清蛋白基因克隆牛的外源基因的插入位點(diǎn)的3'側(cè)翼序列進(jìn)行克隆，得到了26條3'側(cè)翼序列，并依據(jù)其特征將其分成A，B和C三種整合類型。
　　2.在26條3'側(cè)翼序列中存在一個(gè)共同的特征，即當(dāng)外源基因整合到受體染色體上時(shí)，外源片段的3'均在第15821個(gè)核苷酸處發(fā)生斷裂，并且和染色體上的一段大小為200-300bp左右的未知序列相連，命名為UN1，其中227bp在不同3'側(cè)翼序列中完全一致。而在B

3、和C類型的3'側(cè)翼序列中，發(fā)現(xiàn)有另一段未知序列，命名為UN2。
　　3.通過TAIL-PCR未能得到5'側(cè)翼序列，但是通過5'特異引物PCR方法，我們分別得到了樣本081223，樣本172和樣本189的1條5'側(cè)翼序列，與3'側(cè)翼序列結(jié)合，構(gòu)成三個(gè)完整的整合位點(diǎn)。在外源基因整合到染色體上的相接處發(fā)現(xiàn)了拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ的酶切位點(diǎn)。
　　4.在樣本081223中，外源基因整合在牛的1號(hào)染色體的基因組克隆中。分析發(fā)現(xiàn)外源基因5'端缺失

4、417bp，3'端缺失3875bp，并且由于外源基因的整合造成了46bp的染色體缺失，外源基因的3'末端與染色體之間插入了一段262bp的UN1片段。
　　5.樣本172中外源基因整合在牛的2號(hào)染色體的基因組克隆中，分析發(fā)現(xiàn)外源基因5'端缺失482bp，3'端同樣缺失3875bp，并且由于外源基因的整合造成了76bp的染色體缺失。外源基因的3'末端與染色體之間插入了一段263bp的UN1片段。
　　6.樣本189中外源基因整

5、合在牛的24號(hào)染色體的基因組克隆中，分析發(fā)現(xiàn)外源基因5'端缺失290bp，3端缺失3875bp，并且由于外源基因的整合造成98bp的染色體缺失。外源基因的3，末端與染色體之間插入了一段266bp的UN1片段。
　　以上研究結(jié)果說明，當(dāng)外源基因插入到受體基因組時(shí)，受體染色體發(fā)生了復(fù)雜的重排，導(dǎo)致了外源基因和受體染色體不同程度的缺失;在不同的轉(zhuǎn)基因樣本中，插入位點(diǎn)存在著一定的共同特征，以上研究結(jié)果將為探尋轉(zhuǎn)基因插入位點(diǎn)的規(guī)律提供重要依