轉(zhuǎn)基因棉花中外源基因的檢測(cè)及鹽脅迫條件下基因的表達(dá)分析.pdf

1、隨著轉(zhuǎn)基因作物產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程的推進(jìn),越來(lái)越多的轉(zhuǎn)基因作物進(jìn)入食品和醫(yī)藥領(lǐng)域,因此建立快速有效的檢測(cè)技術(shù)已成為世界各國(guó)轉(zhuǎn)基因授權(quán)評(píng)估機(jī)構(gòu)所面臨的巨大挑戰(zhàn)。
　　 本論文利用多重PCR和微流體芯片技術(shù)建立轉(zhuǎn)基因棉花外源基因的檢測(cè)體系。該體系通過(guò)多重PCR技術(shù)高通量擴(kuò)增棉花外源基因的同時(shí)運(yùn)用微流體芯片對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行特異性地檢測(cè)。本論文根據(jù)轉(zhuǎn)基因數(shù)據(jù)庫(kù)中絕大多數(shù)植物的外源基因序列設(shè)計(jì)探針1032條,制備具有篩選基因、目的基因、交聯(lián)結(jié)構(gòu)序列、

2、特異性結(jié)構(gòu)序列和16種經(jīng)濟(jì)作物種屬內(nèi)參基因的綜合性基因芯片。多重PCR技術(shù)的關(guān)鍵在于多重PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化,本文從多重引物組合、PCR反應(yīng)體系、PCR反應(yīng)條件這三個(gè)方面對(duì)轉(zhuǎn)基因棉花多重PCR反應(yīng)進(jìn)行優(yōu)化,建立了擴(kuò)增效率較高的轉(zhuǎn)基因棉花中棉41的六重PCR反應(yīng)體系,優(yōu)化后的體系為Hotstar Taq DNA聚合酶用量為1.25 U/50μl,鎂離子的終濃度為3.5 mM,dNTP的終濃度為400μM,BSA(10mg/ml)的加入量為

3、2μl,選取58℃為反應(yīng)擴(kuò)增的退火溫度。利用優(yōu)化的多重PCR體系進(jìn)行熒光標(biāo)記后與芯片雜交特異性地檢測(cè)到轉(zhuǎn)基因棉花中棉41中的外源基因啟動(dòng)子CaMV35S、終止子TNOS、報(bào)告基因NPTII和抗蟲基因Cry1Ac。本論文建立了六重PCR偶聯(lián)微流體芯片高通量檢測(cè)轉(zhuǎn)基因棉花的體系,為轉(zhuǎn)基因植物的檢測(cè)提供技術(shù)參考。
　　 棉花是適度耐鹽的非鹽生植物,但高濃度的鹽離子仍會(huì)嚴(yán)重影響棉花的產(chǎn)量和棉纖維的品質(zhì)。通過(guò)土地改良來(lái)改善日益加劇的土地鹽

4、堿化問(wèn)題因效益和成本問(wèn)題而擱置,因此通過(guò)轉(zhuǎn)基因的方式提高作物的耐鹽能力是目前解決土地鹽堿化問(wèn)題的有效方法?？果}棉花的培育已成為棉花轉(zhuǎn)基因研究領(lǐng)域的熱點(diǎn),需要建立相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)技術(shù)以滿足抗鹽轉(zhuǎn)基因棉花涌入市場(chǎng)的趨勢(shì),但棉花在鹽脅迫下的分子調(diào)控機(jī)制還不是很透徹,因此深入研究棉花的耐鹽調(diào)控機(jī)理為抗鹽脅迫轉(zhuǎn)基因棉花的培育提供候選基因。
　　 本論文開展了鹽脅迫下苗期轉(zhuǎn)基因棉花中棉41和中棉23的表達(dá)譜研究,對(duì)鹽處理前后的棉花幼苗差異表