影響轉(zhuǎn)基因動物中外源基因表達的研究.pdf

1、轉(zhuǎn)鐵蛋白(transferrin，TF)是體內(nèi)鐵離子運輸?shù)妮d體，對于個體的生長發(fā)育有很重要作用，因此運用轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)轉(zhuǎn)鐵蛋白具有很好的臨床價值和經(jīng)濟前景。本實驗通過細胞水平和個體水平研究證明了基因的甲基化影響外源基因hTF表達水平，并初步探討了這一表達調(diào)控機制，為進一步提高hTF的表達水平提供理論依據(jù)。 本實驗擴增了兔TF啟動子（RP)啟動hTF表達的重組載體，并純化了該質(zhì)粒載體,細胞瞬時轉(zhuǎn)染實驗證明，在BRL-3A（大鼠肝

2、臟細胞系）和HC-11（小鼠乳腺上皮細胞系）中，RP啟動子可以高效啟動外源基因hTF的表達。實驗進一步得到了兩個穩(wěn)定表達hTF的BRL-3A細胞克隆，使用5-雜胞苷（5-aza-dC）處理兩個穩(wěn)定克隆發(fā)現(xiàn)，5-aza-dC可以明顯提高外源基因hTF的表達水平，且提高程度與5-aza-dC的用量成正比，說明在細胞水平外源基因hTF的表達受到甲基化的調(diào)控。兩個細胞克隆表達hTF的能力不同，相差一個數(shù)量級，而且使用相同濃度的5-aza處理兩個

3、克隆，發(fā)現(xiàn)兩個克隆外源基因的表達升高程度不一樣，提示外源基因的表達除了受甲基化影響，還受到如整合位點和拷貝數(shù)等因素影響。 本實驗為了在個體水平探討hTF的表達調(diào)控機制，使用慢病毒感染制備得到了一批表達水平各異的轉(zhuǎn)基因小鼠，通過定量PCR的方法，鑒定并得到了一批單位點單拷貝的F1代轉(zhuǎn)基因小鼠。通過分析三只小鼠F1-797，F(xiàn)1-949和F1-972的心，肝，脾，肺，腎，腦，睪丸，肌肉八種臟器hTF的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)現(xiàn)，RP啟動子啟動h

4、TF表達具有組織傾向性，在肝臟和腦中hTF表達較高，肌肉表達較低。進一步分析了F1-797和F1-949小鼠的肝臟，心臟和肌肉的hTF轉(zhuǎn)錄水平和其RP啟動子的甲基化程度發(fā)現(xiàn)，表達hTF最強的肝臟，其啟動子甲基化程度最低，幾乎不表達hTF的肌肉，其啟動子幾乎完全甲基化，心臟表達hTF 中等，甲基化程度也中等。也就是說，hTF轉(zhuǎn)錄水平與其啟動子甲基化程度呈負相關(guān)。 另外對F1-797，F(xiàn)1-949和F1-972小鼠的肝臟中hTF的

5、表達水平和啟動子的甲基化的分析發(fā)現(xiàn)，高表達hTF的F1-797和F1-949，其肝臟外源基因啟動子低甲基化，中表達hTF的F1-972小鼠，其肝臟外源基因啟動子甲基化程度要略高一些。實驗結(jié)果亦證實，hTF的轉(zhuǎn)錄水平與啟動子的甲基化程度是負相關(guān)。 實驗最后還分析了每一個CpG雙聯(lián)體在基因表達調(diào)控中的作用。數(shù)據(jù)顯示，hTF表達越高，RP的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點PRI，RNA聚合酶結(jié)合位點以及KOZAK序列的CpG雙聯(lián)體表現(xiàn)出低于平均水平