轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳汁中高效、穩(wěn)定表達(dá)人FVⅢ的研究.pdf

1、人凝血因子VIII（hFVIII）是一種重要的凝血蛋白，它的缺失或缺乏會(huì)導(dǎo)致血友病A。目前血友病A的治療方法主要是注射給病人重組凝血因子VIII蛋白或來源于血漿的VIII因子濃縮產(chǎn)品。但目前這些方法存在病毒污染、產(chǎn)量低、價(jià)格昂貴等風(fēng)險(xiǎn)，近年來動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器以其產(chǎn)量高、成本低、生物活性高的優(yōu)勢成為一種新型的生物制藥模式，本工作目的為研制用于動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn) hFVIII的高效表達(dá)載體，并在細(xì)胞和小鼠水平上分別進(jìn)行其體外、體內(nèi)表達(dá)

2、系統(tǒng)的研究。
　　在本文的第一部分，我們分別構(gòu)建了由巨細(xì)胞病毒（CMV）、山羊β-酪蛋白調(diào)控序列（P1A3)和小鼠血清白蛋白調(diào)控序列（Pa lb）為啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的表達(dá)全長hFVIII和B區(qū)缺失（刪除了編碼760aa-1639aa的核苷酸序列）hFVIIIBDD cDNA的六種真核載體。轉(zhuǎn)染細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，六種載體在轉(zhuǎn)錄水平均有hF VIII的表達(dá)。將所構(gòu)建的載體瞬時(shí)注射哺乳期的小鼠乳腺，ELISA檢測結(jié)果顯示，CMV-hFVIII

3、和P1A3-hFVIII質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的小鼠乳汁中hFVIII的最高含量分別為2.01±0.23和1.20±0.21μg/mL，Palb-hFVIII和Palb-hFVIIIBDD轉(zhuǎn)染后在小鼠乳汁中檢測不到表達(dá)。CMV-hFVIIIBDD和P1A3-hFVIIIBDD質(zhì)粒的表達(dá)情況與全長hFVIII相符，且瞬時(shí)轉(zhuǎn)染小鼠乳腺后在乳汁中的最高表達(dá)量分別為2.81±0.31和1.82±0.25μg/mL，均高于同種啟動(dòng)子之全長hFVIII的表達(dá)量

4、。
　　本文第二部分的研究內(nèi)容為，分別將CMV、P1A3和Palb啟動(dòng)子連接的hFVIII及hFVIIIBDD片段構(gòu)建的六種載體，分別通過顯微注射制備轉(zhuǎn)基因小鼠，應(yīng)用RT-PCR、real time PCR、ELISA、IHC和Western blot等方法檢測各載體在小鼠各臟器中的hFVIII的表達(dá)及分布。結(jié)果顯示，CMV-hFVIII（hFVIIIBDD）在轉(zhuǎn)基因小鼠的各個(gè)臟器中均有hFVIII表達(dá)，而Palb-hFVIII（

5、hFVIIIBDD）和P1A3-hFVIII（hFVIIIBDD）分別在肝臟和乳腺中特異表達(dá)hFVIII。且P1A3-hFVIII和P1A3-hFVIIIBDD轉(zhuǎn)基因小鼠乳汁中hFVIII平均濃度分別為1.16±0.80μg/mL和2.45±0.80μg/mL，其相應(yīng)的平均活性分別為337±118 mU/mL和662±114mU/mL。各種轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型小鼠相比，沒有不良的生理異常如呼吸困難，不育或哺乳障礙等。由于P1A3啟動(dòng)子的h

6、FVIIIBDD載體具有乳腺組織特異表達(dá)的特點(diǎn)，且能高效表達(dá)有活性的重組hFVIII，因此更適用于乳腺生物反應(yīng)器的研制。
　　在本文的第三部分，重點(diǎn)開展了利用血管性血友病因子（vWF)在hFVIII轉(zhuǎn)基因小鼠的乳汁中共表達(dá)來提高h(yuǎn)FVIII穩(wěn)定性的研究。我們構(gòu)建了vWF與hFVIII的共表達(dá)載體P1A3-hFVIIIBDD-IRES-vWF，并制備其相應(yīng)的共表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠，在不同儲(chǔ)存條件和不同時(shí)間點(diǎn)分別檢測轉(zhuǎn)基因小鼠乳汁中的hF

7、VIII發(fā)現(xiàn)，其hFVIII活性在體外降解到一半的時(shí)間（Td1/2v）分別是77.21h（4oC）,32.45h（室溫）和7.40h（37oC）；明顯的高于P1A3-hFVIIIBDD小鼠的時(shí)間43.82h（4oC），19.67h（常溫）和3.44h（37oC），相同條件下的兩組數(shù)值之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。同時(shí)我們也利用CMV-vWF載體生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因小鼠，獲得的CMV-vWF轉(zhuǎn)基因小鼠與P1A3-hFVIIIBDD轉(zhuǎn)基因小鼠雜交

8、獲得P1A3-hFVIIIBDD/CMV-vWF雙重雜合子小鼠。檢測雙重雜合子轉(zhuǎn)基因小鼠乳汁中hFVIII的活性，結(jié)果顯示不同條件下hFVIII活性的Td1/2v值與P1A3-hFVIIIBDD-IRES-vWF共表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠的時(shí)間相似，兩者間數(shù)值無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。綜上結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)基因小鼠乳汁中vWF的共表達(dá)能對(duì)凝血因子VIII起到明顯的穩(wěn)定作用。鑒于雙重雜合子的制備耗時(shí)耗力，且傳代過程中性狀會(huì)發(fā)生分離等特點(diǎn)，P1A3-hFVIIIBD

9、D-IRES-vWF共表達(dá)載體更適用于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器的研制。
　　本研究結(jié)果表明，（1）P1A3啟動(dòng)子能啟動(dòng)hFVIII在小鼠乳腺組織特異表達(dá)；（2）P1A3引導(dǎo)的hFVIII（hFVIIIBDD）基因在轉(zhuǎn)基因小鼠乳汁中能表達(dá)有凝血活性的hFVIII，且B區(qū)缺失的hFVIIIBDD載體在轉(zhuǎn)基因小鼠乳汁中的hFVIII蛋白表達(dá)量高于全長的hFVIII載體；（3）在hFVIII轉(zhuǎn)基因小鼠乳汁中共表達(dá)的vWF可以明顯增加hF