Fat-1轉(zhuǎn)基因克隆渤海黑牛研究.pdf

1、Fat-1基因編碼的產(chǎn)物是多不飽和脂肪酸脫氫酶，能將n-6多不飽和脂肪酸(PUFAs)轉(zhuǎn)化為n-3 PUFAs。本研究利用MAR（matrix attachment regions）序列作為啟動(dòng)元件，構(gòu)建了MAR-CAG-Fat-1-PolyA-MAR單順反子表達(dá)盒，轉(zhuǎn)染渤海黑牛胎兒成纖維細(xì)胞，通過有限稀釋法挑取單克隆細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，提取基因組DNA進(jìn)行鑒定，獲得了轉(zhuǎn)基因陽性單克隆細(xì)胞系。然后，對(duì)轉(zhuǎn)基因陽性細(xì)胞DNA整合，RNA、蛋白表達(dá)

2、、脂肪酸含量等鑒定分析。用pMAR-CAG-Fat-1-PolyA-MAR載體（單酶切載體）和MAR-CAG-Fat-1-PolyA-MAR載體（雙酶切載體）分別制備轉(zhuǎn)基因小鼠。將表達(dá)良好的轉(zhuǎn)基因單克隆細(xì)胞通過體細(xì)胞核移植技術(shù)制備克隆胚胎。結(jié)果表明，(1)獲得了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染雙酶切載體的單克隆陽性細(xì)胞系，該細(xì)胞系的n-3 PUFAs表達(dá)水平升高且n-6/n-3PUFAs的比值降低。脂肪酸合成基因FASN、ACC、SREBP-1表達(dá)與對(duì)照相比明

3、顯降低，脂肪酸代謝基因PPARA、PPARG降低。細(xì)胞中fatl蛋白表達(dá)。(2)獲得了雙酶切和單酶切載體的轉(zhuǎn)基因小鼠。其中轉(zhuǎn)基因雙酶切鼠F0代7只，F(xiàn)1代3只，F(xiàn)2代2只;轉(zhuǎn)基因單酶切鼠F0代7只，F(xiàn)1代28只。轉(zhuǎn)基因雙酶切鼠F0、F1和F2代鼠的肌肉和脂肪組織中n-3 PUFAs含量均升高，n-6/n-3PUFAs比值均降低;轉(zhuǎn)基因單酶切鼠肌肉和脂肪組織中n-3 PUFAs含量降低，n-6/n-3 PUFAs比值升高。(3)雙酶切鼠肌

4、肉組織中脂肪酸相關(guān)基因?qū)崟r(shí)定量分析，發(fā)現(xiàn)脂肪酸合成基因FASN、ACC、SREBP-1表達(dá)與對(duì)照相比明顯降低，脂肪酸代謝基因PPARA、PPARG表達(dá)降低。(4)蛋白差異表達(dá)和動(dòng)態(tài)定量分析，發(fā)現(xiàn)單酶切組試驗(yàn)差異蛋白有99個(gè)，其中上調(diào)蛋白62個(gè)，下調(diào)蛋白37個(gè);雙酶切組試驗(yàn)差異蛋白有118個(gè)，其中上調(diào)蛋白81個(gè)，下調(diào)蛋白37個(gè)。(5)利用表達(dá)良好的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系為核供體生產(chǎn)24枚克隆胚胎，移植受體母畜12頭，有2頭妊娠。其中1頭發(fā)育到期并生