Fat-1表達(dá)載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)Fat-1基因薩?？搜虺衫w維細(xì)胞系的建立研究.pdf

1、目的:ω-3PUFAs對于維持生命有機(jī)體的正常發(fā)育和生長,防治各種疾病都有至關(guān)重要的作用,由于缺乏能夠?qū)ⅵ?6PUFAs轉(zhuǎn)化成ω-3PUFAs的脫氫酶基因,人體內(nèi)的ω-6/ω-3PUFAs達(dá)不到1:1理想的平衡,所以每天必須攝入一定量的ω-3PUFAs,來保證有機(jī)體正常的功能和自身穩(wěn)定。目前富含ω-3PUFAs食物主要是深海魚類,來源范圍很窄,導(dǎo)致人體內(nèi)ω-6PUFAs過多而ω-3PUFAs嚴(yán)重不足,對嬰幼兒智力發(fā)育、心腦血管疾病和癌癥

2、的預(yù)防起不了積極作用。因此從家畜繁殖與育種的角度出發(fā),制備能夠表達(dá)ω-3PUFAs的脫氫酶基因Fat-1的新品種綿羊,從而培育出富含ω-3PUFAs高品質(zhì)羊肉。
　　方法:1.Fat-1表達(dá)載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系建立
　　采用組織塊附植法分離得到了18月齡薩?？斯虺衫w維細(xì)胞系;通過PCR擴(kuò)增得到了人泛素啟動子UbB序列,對秀麗隱桿線蟲Fat-1基因密碼子根據(jù)綿羊?qū)νx密碼子使用偏好性進(jìn)行優(yōu)化,然后由公司合成獲得oFat-1

3、基因序列;雙酶切法從pcDNA3.1中獲得GBHpolyA序列,將上述3段序列共同插入pCMV-DsRed2-1載體的多克隆位點(diǎn)(MCS),得到重組真核表達(dá)載體pUbB-oFat-polyA-CMV-DsRed,載體序列再經(jīng)酶切和測序,結(jié)果與預(yù)期一致。用單酶切法將表達(dá)載體線性化后,采用脂質(zhì)體包裹后轉(zhuǎn)染綿羊成纖維細(xì)胞,經(jīng)G418抗性和紅色熒光標(biāo)記篩選得到陽性細(xì)胞,并進(jìn)行PCR和反轉(zhuǎn)錄PCR鑒定,HPLC檢測細(xì)胞中不飽和脂肪酸的變化。

4、>　　2.轉(zhuǎn)基因綿羊的制備
　　將得到的轉(zhuǎn)Fat-1的綿羊成纖維細(xì)胞作為核移植供體細(xì)胞,移入去核后的綿羊成熟卵母細(xì)胞內(nèi)制備克隆胚,經(jīng)過融合、激活、發(fā)育得到的2細(xì)胞期重構(gòu)胚,移入同步處理的31只受體羊子宮內(nèi),6-7枚/羊,妊娠并產(chǎn)下羔羊后PCR初步檢測外源基因,分別取三只羊耳部皮膚體外培養(yǎng),進(jìn)行細(xì)胞染色體數(shù)目分析。
　　結(jié)果:構(gòu)建的真核表達(dá)載體序列正確,Fat-1基因能夠在綿羊成纖維細(xì)胞基因組中正常表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞ω-6PUFA

5、s向ω-3PUFAs轉(zhuǎn)化,ω-3PUFAs占總量的百分比從11.48％增加到24.41%,ω-6PUFAs的百分比從88.52%下降到75.59%,ω-6PUFAs/ω-3PUFAs比值從7.82±0.18下降到3.10±0.03,差異極顯著(P<0.01)。經(jīng)過胚胎移植后有3只母羊妊娠,妊娠率9.67%,并順利產(chǎn)下3只羔羊。經(jīng)PCR初步檢測有兩只為轉(zhuǎn)基因陽性,分別取三只羊耳部皮膚體外培養(yǎng),進(jìn)行細(xì)胞染色體數(shù)目分析,顯示均具有正常的二倍體