基于fat-1轉(zhuǎn)基因牛的自身安全評價.pdf

1、n-3多不飽和脂肪酸(n-3 PUFAs)與人類的健康密切相關(guān)，但人體自身不能合成n-3 PUFAs。自1997年，Spychalla等在線蟲中獲得了一個脂肪酸脫氫酶基因fat-1后，多種富含n-3 PUFAs的fat-1轉(zhuǎn)基因動物相繼被研制成功，使這些轉(zhuǎn)基因動物的產(chǎn)品為人類提供必需的n-3 PUFAs成為了可能。隨著fat-1轉(zhuǎn)基因家畜的大量出生，涉及轉(zhuǎn)基因家畜的生物安全成為了人類倍受關(guān)注的問題，其中轉(zhuǎn)基因家畜自身健康是生物安全檢測的

2、一項重要內(nèi)容。截止目前，轉(zhuǎn)基因家畜自身健康和安全的評價雖已開展了一些研究，但多局限于動物健康的某個方面，系統(tǒng)而全面評價轉(zhuǎn)基因家畜自身健康的研究還未見報道。本研究利用體細胞核移植技術(shù)最終獲得了3頭成活的fat-1轉(zhuǎn)基因牛，高通量測序技術(shù)鑒定了其中一頭轉(zhuǎn)基因牛的fat-1基因整合在16號染色體的15726078bp處。通過對3頭fat-1轉(zhuǎn)基因牛在血液生化水平、基因漂移、自身基因表達變化、血漿蛋白表達變化及腸道菌群變化結(jié)果的系統(tǒng)分析，發(fā)現(xiàn)f

3、at-1基因的轉(zhuǎn)入對轉(zhuǎn)基因牛的脂類代謝、免疫、心血管系統(tǒng)、抗應激等方面均表現(xiàn)出調(diào)節(jié)作用。實驗結(jié)果對于建立轉(zhuǎn)基因家畜，特別是轉(zhuǎn)基因大家畜的自身安全評價體系，為獲得健康、安全的轉(zhuǎn)基因家畜的相關(guān)研究提供了有價值的參考資料。主要研究結(jié)果如下:
　　1.fat-1轉(zhuǎn)基因牛的生產(chǎn)及常規(guī)分析
　　通過轉(zhuǎn)基因及體細胞核移植技術(shù)(SCNT)獲得了9頭犢牛，6頭犢牛被鑒定為fat-1轉(zhuǎn)基因陽性牛，脂肪酸檢測證實了fat-1基因的轉(zhuǎn)入可以提升牛體

4、內(nèi)n-3PUFAs的含量，降低n-6 PUFAs的含量。血液生化水平檢測，發(fā)現(xiàn)fat-1基因的轉(zhuǎn)入顯著降低了犢牛ALT及成年牛AST、GLU、TC和LDL-C的水平。常規(guī)PCR檢測轉(zhuǎn)基因牛腸道糞便、圈舍中土壤及其周圍200 m各方位土壤微生物，均未發(fā)現(xiàn)有fat-1基因的存在。
　　2.fat-1轉(zhuǎn)基因牛整合位點分析
　　應用高通量測序技術(shù)對fat-1轉(zhuǎn)基因牛(FD006)進行了外源基因整合位點分析，結(jié)果表明fat-1基因整合

5、在牛16號染色體的15726078bp處，且為單拷貝，根據(jù)測序獲得的插入位點及其附近reads的結(jié)果分析，顯示FD006為雜合子轉(zhuǎn)基因牛，PCR的驗證結(jié)果證實了fat-1基因確實插入了牛16號染色體的15726078 bp處，而且確實為雜合子轉(zhuǎn)基因牛。本研究為轉(zhuǎn)基因牛的整合位點分析、外源基因定點整合以及穩(wěn)定表達等研究提供了技術(shù)路線與理論依據(jù)。
　　3.fat-1轉(zhuǎn)基因?；虮磉_變化研究
　　為分析fat-1基因的轉(zhuǎn)入對?；?/p>

6、表達的影響，提取fat-1轉(zhuǎn)基因牛和野生型牛血液的總RNA，進行基因表達譜芯片檢測。結(jié)果表明，有2042個基因表達存在顯著差異，其中797個基因在fat-1轉(zhuǎn)基因牛中是上調(diào)表達的，其余1245個基因則下調(diào)表達?；?042個差異基因進行GO富集分析，發(fā)現(xiàn)90個GO Terms被顯著富集，這些GO Terms主要與機體的脂類代謝、細胞行為、免疫及神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育密切相關(guān)，其中8個GO Terms中包含了36個發(fā)生顯著變化的脂類代謝關(guān)鍵基因。K

7、EGG富集分析進一步獲得了與脂類代謝，特別是與多不飽和脂肪酸的代謝密切相關(guān)的“PPAR signaling pathway”代謝通路。應用Real-time PCR對芯片檢測獲得的16個脂類代謝關(guān)鍵基因進行驗證，證實了芯片獲得的結(jié)果是可信的。綜合以上結(jié)果，發(fā)現(xiàn)fat-1基因的轉(zhuǎn)入引起了牛自身基因表達水平的變化，這些變化的基因在機體的脂類代謝、免疫、神經(jīng)發(fā)育等生物學通路表現(xiàn)出調(diào)節(jié)作用。
　　4.fat-1轉(zhuǎn)基因牛血漿蛋白組學研究

8、r>　　利用2D-雙向電泳及質(zhì)譜檢測技術(shù)對fat-1轉(zhuǎn)基因牛血漿蛋白組學進行了分析。結(jié)果表明，共有15個血漿差異蛋白被鑒定;對這15個差異蛋白及其互作蛋白的GO和KEGG富集分析，發(fā)現(xiàn)這些蛋白主要參與了機體的脂類代謝、免疫、應激、神經(jīng)發(fā)育和血液凝固等生物學通路的調(diào)節(jié);在18個重要的脂類代謝生物學通路中，有12個通路都富集到了APOA1，表明fat-1基因參與對脂類代謝的調(diào)控可能與APOA1有密切關(guān)系;血漿APOA1檢測發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因牛血漿

9、中APOA1含量顯著高于野生型牛，其表達水平與LDL-C高度負相關(guān)(r=-0.90)，與HDL-C/TC比值存在顯著正相關(guān)(r=0.69)。綜合以上結(jié)果，與野生型牛比較發(fā)現(xiàn)，fat-1基因的轉(zhuǎn)入使牛血漿中的一些蛋白表達發(fā)生了變化，并發(fā)現(xiàn)fat-1基因可能會介導APOA1的表達參與轉(zhuǎn)基因牛脂類代謝的調(diào)控。
　　5.fat-1轉(zhuǎn)基因牛腸道微生物菌群的研究
　　采用高通量測序技術(shù)，分別對3頭fat-1轉(zhuǎn)基因牛和3頭野生型牛的直腸糞

10、便進行了基于16s rDNA V4可變區(qū)腸道菌群多樣性及組成的比較分析。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因牛和野生型牛共獲得9714個OTUs的分類，轉(zhuǎn)基因牛的OTUs分類（8907個）明顯少于野生型牛（9488個）;物種多樣性指數(shù)分析發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因牛的Chao和Shannon指數(shù)均顯著低于野生型牛(p＜0.05)。進一步的分析發(fā)現(xiàn)，fat-1基因的轉(zhuǎn)入也改變了牛腸道菌群的組成和表達豐度。其中物種注釋豐度比較發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因牛與野生型牛間有3個門（廣古菌門、變

11、形菌門、螺旋體門），9個屬（紫單胞菌屬、擬桿菌屬、甲烷短桿菌、密螺旋體屬、梭菌屬、毛螺菌屬、羅氏菌屬、消化球菌屬、丁酸弧菌屬）存在物種豐度差異(p＜0.05)。結(jié)合腸道菌群的組成、物種豐度比較結(jié)果及血糖、血脂生化檢測結(jié)果，發(fā)現(xiàn)Dorea、Roseburia、Succinivibrio和Alistipes與血糖、血脂的變化存在一定的相關(guān)性。此外，也發(fā)現(xiàn)與應激有關(guān)的Odoribacter菌屬在轉(zhuǎn)基因牛腸道中顯著降低。綜合本研究結(jié)果表明，fa