牛FABP3轉(zhuǎn)基因小鼠的遺傳檢測(cè)及功能驗(yàn)證.pdf

1、FABP3基因是影響牛肌內(nèi)脂肪沉積的重要基因，與大理石花紋、背膘厚、剪切力等指標(biāo)具有較高的相關(guān)性，因此，將該基因轉(zhuǎn)入小鼠體內(nèi)，研究牛FABP3基因在小鼠體內(nèi)遺傳和表達(dá)特性，明確該基因功能，對(duì)培育優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)轉(zhuǎn)基因肉牛新品種具有重要意義。本研究主要將牛FABP3基因轉(zhuǎn)入小鼠體內(nèi)，并檢測(cè)了目的基因FABP3在轉(zhuǎn)基因小鼠及其子代小鼠體內(nèi)的遺傳情況;同時(shí)，利用熒光定量和組織原位雜交技術(shù)驗(yàn)證小鼠不同組織中牛FABP3基因表達(dá)水平，以及轉(zhuǎn)基因小鼠在營(yíng)養(yǎng)

2、調(diào)控下的脂肪代謝相關(guān)血液生化指標(biāo)差異，以期探明轉(zhuǎn)牛FABP3基因小鼠的遺傳與表達(dá)水平，為牛FABP3基因功能研究奠定基礎(chǔ)，也為牛的分子遺傳育種提供理論依據(jù)。本研究取得結(jié)果如下:
　　(1)通過(guò)活體熒光鑒定和RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果表明前期獲得4只G0轉(zhuǎn)基因小鼠（2雌2雄）為陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因個(gè)體，可以用于后續(xù)的遺傳檢測(cè)和基因功能研究。
　　(2)對(duì)4只G0代陽(yáng)性個(gè)體制定4組交配方案并獲得G1代子鼠，對(duì)G1子鼠進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)和測(cè)序及

3、Blast比對(duì)，結(jié)果表明陽(yáng)性個(gè)體擴(kuò)增片段均包含EGFP報(bào)告基因和牛FABP3目的基因;G1代子鼠平均陽(yáng)性率為67.8％，且不同組間陽(yáng)性率存在差異，其中組1陽(yáng)性率最高為100％。
　　(3)對(duì)G1代轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性率為100％的組1內(nèi)個(gè)體進(jìn)行隨機(jī)交配并傳代至G4代，通過(guò)PCR擴(kuò)增檢測(cè)和測(cè)序及Blast比對(duì)發(fā)現(xiàn)，G2代子鼠平均陽(yáng)性率為100％，G3代為33.3％，G4代為18.75明，G0代轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性小鼠可將目的基因遺傳給后代，但隨著代次的

4、增加，目的基因在后代個(gè)體中比例呈下降。
　　(4)利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，在mRNA水平對(duì)牛FABP3基因在G0代和G1代小鼠心臟、肝臟、腎臟、骨骼肌組織的表達(dá)情況進(jìn)行了檢測(cè)和表達(dá)量分析。結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因小鼠心肌和骨骼肌中總FABP3表達(dá)量顯著高于非轉(zhuǎn)基因個(gè)體(P＜0.05)。
　　(5)利用Western Blot、對(duì)G0、G1、G2、G3代陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因小鼠心肌和骨骼肌中FABP3蛋白以及GFP蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)

5、果表明陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因小鼠中FABP3基因的表達(dá)量相對(duì)野生型個(gè)體有所增加,GFP蛋白可以在小鼠的心臟和骨骼肌中得到表達(dá)。
　　(6)對(duì)G1代轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行飼養(yǎng)試驗(yàn)，即在高油營(yíng)養(yǎng)水平對(duì)牛FABP3基因功能的驗(yàn)證。結(jié)果表明高油日糧組轉(zhuǎn)基因小鼠和非轉(zhuǎn)基因小鼠體重差異不顯著(P＞0.05)，普通日糧組轉(zhuǎn)基因小鼠與非轉(zhuǎn)基因小鼠體重差異不顯著(P＞0.05)，轉(zhuǎn)基因高油日糧小鼠與非轉(zhuǎn)基因日糧小鼠差異顯著(P＜0.05)。通過(guò)血液生化指標(biāo)檢測(cè)，轉(zhuǎn)基因

6、高油日糧小鼠膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、肌酐等含量均略高于野生型普通日糧個(gè)體。
　　(7)對(duì)轉(zhuǎn)基因小鼠G0、G1代個(gè)體進(jìn)行了組織原位表達(dá)檢測(cè)，在G0代個(gè)體中表達(dá)量較高，G1代個(gè)體中能看到綠色熒光，但略有降低。結(jié)果也表明GFP蛋白可以在小鼠體內(nèi)表達(dá)，并能夠在遺傳中傳遞給下一代。這與蛋白質(zhì)免疫印跡中GFP檢測(cè)結(jié)果相一致。
　　(8)通過(guò)基因捕獲技術(shù)，分析外源基因在小鼠基因組中的整合位點(diǎn)，結(jié)果檢測(cè)到2只轉(zhuǎn)基因小鼠