IL34轉基因小鼠的建立和表型分析.pdf

1、背景:白介素34(Interleukin 34, IL34)是近年來發(fā)現的白介素家族的新成員。它是集落刺激因子受體(Colony stimulating factor 1 receptor, CSF1R)的另一個配體,主要在脾組織表達。IL34與巨細胞集落刺激因子(Macrophage-colony stimulating factor, M-CSF)通過與CSF1R結合都能刺激骨髓細胞培養(yǎng)中巨噬細胞克隆的形成及維持外周血單核細胞的生長

2、,但是活化的程度不同。現在對IL34的研究主要集中在對骨巨細胞瘤中破骨細胞的影響和血中對其它細胞因子的刺激作用,在臨床上M-CSF和CSF1R與各種炎癥和自身免疫病相關如風濕性關節(jié)炎、腎炎、肺炎、動脈粥樣硬化、骨巨細胞瘤等,所以IL34與這些疾病發(fā)生發(fā)展的關系引起人們的關注,但對其相關免疫疾病的研究尚少。目前對于內源性IL34對機體的作用尚未有報道。因此我們建立白介素34轉基因小鼠,為近一步研究高表達的IL34表達對小鼠免疫系統(tǒng)的作用和

3、免疫相關疾病的發(fā)生發(fā)展提供模型。方法:把人的IL34基因插入CMV啟動子下,構建IL34轉基因表達載體,通過顯微注射法建立IL34轉基因C57BL/6J小鼠。PCR鑒定IL34轉基因小鼠的基因表型,Western blotting檢測IL34蛋白的表達水平,組織化學染色觀察IL34轉基因小鼠重要器官的病理改變。結果:建立了2個品系的IL34轉基因小鼠。轉入的人IL34基因在脾臟中的表達水平高于內源性IL34。組織學分析顯示IL34轉基因

4、小鼠各重要器官如腦,心,肝,腎,腸等的形態(tài)結構均正常,但脾臟的生發(fā)中心比較活躍,白髓的范圍比野生型小鼠大。結論:建立了IL34轉基因小鼠,為研究IL34基因對免疫系統(tǒng)作用建立了模型。背景心血管病是危害人類健康的最常見疾病。了解有哪些修飾基因調節(jié)心肌細胞從正常的生理狀態(tài)發(fā)展為心肌擴張和肥厚,對心肌病發(fā)生機制具有重要意義。但是,目前對這些基因了解很少。Tomoregulin1是最近發(fā)現的新基因,主要在胚胎生長軸和成體腦神經系統(tǒng)中表達,參與胚

5、胎生長軸和成體腦神經系統(tǒng)的發(fā)育調節(jié)?，F在tomoregulin1的研究主要集中在腫瘤,腦的神經系統(tǒng)和胚胎發(fā)育等方面,該基因在正常心臟中表達很低,但我們實驗室的芯片分析提示,在肥厚性心肌病小鼠中表達較高,有可能是參與心肌肥厚發(fā)病過程的基因調節(jié)網絡的重要節(jié)點基因。目前沒有該基因對心臟作用的研究報道。因此本文特建立過表達tomoregulin1基因的H9C2穩(wěn)定細胞系和心臟特異表達tomoregulin1的轉基因小鼠,以研究tomoregul

6、in1對心肌細胞和心臟組織的調節(jié)作用。方法:將tomoregulin1基因插入CMV啟動子下游,構建tomoreglin1轉基因表達載體,通過細胞轉染建立過表達tomoregulin1基因的H9C2穩(wěn)定細胞系,Western blotting篩選過表達tomoregulin1基因的H9C2穩(wěn)定細胞系,繪制細胞生長曲線觀察tomoregulin1細胞的生長狀態(tài)和增長速度。BrdU免疫組織化學法檢測tomoregulin1細胞的增殖速度。W

7、estern blotting檢測tomoregulinl細胞的信號通路。將tomoregulin1基因插入心肌特異α-MHC啟動子下游,構建心臟特異tomoreglinl轉基因表達載體,通過顯微注射法建立tomoregulinl轉基因C57BL/6J小鼠,PCR鑒定轉基因小鼠的基因型。結果:將tomoregulin1基因插入pcDNA3.1載體中,構建表達tomoregulin1的表達載體,通過細胞轉染H9C2細胞株建立了穩(wěn)定表達to

8、moregulin1的細胞系。Western blotting檢測tomoregulin1的蛋白表達水平篩選兩個過表達tomoregulinl的H9C2細胞系。通過觀察H9C2和tomoregulinl生長數繪制的生長曲線顯示,tomoregulinl細胞的生長速度比H9C2慢。BrdU免疫組織化學法檢測H9C2細胞和tomoregulin1細胞的增殖,發(fā)現tomoregulin1細胞增殖的速度明顯低于H9C2細胞,H9C2細胞BrdU

9、標記的陽性細胞指數為22％,而tomoregulin1細胞的陽性指數只有8%,兩者之間具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。Western blotting檢測tomoregulin1細胞內的信號蛋白,結果顯示磷酸化ERK1/2和AKT的表達量遠遠低于H9C2細胞。受體蛋白TGFβreceptorⅠ的表達量也減少,但是TGFβreceptorⅡ的表達量卻無明顯改變。在加入cripto蛋白刺激24小時以后,再提取蛋白做western blot檢

10、測發(fā)現磷酸化ERK1/2和AKT,TGFβreceptor I,TGFβreceptorⅡ蛋白的表達量都無差異。通過顯微注射,建立了心臟特異表達tomoregulin1基因轉基因小鼠品系,并通過PCR鑒定tomoregulin1轉基因小鼠的基因型,共得到4只首建鼠。結論:tomoregulin1抑制心肌細胞的生長速度,發(fā)現tomoregulin1通過TGFβreceptorⅠ抑制ERK1/2和AKT信號轉導通路,實現對心肌細胞的生長起到