miR-128-2骨髓嵌合和轉(zhuǎn)基因小鼠模型的建立及其免疫表型分析.pdf

1、microRNAs（miRNAs）是真核生物中一類長度約為22個(gè)核苷酸，參與基因轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控的非編碼小分子RNA。近年來研究發(fā)現(xiàn)，MiRNAs參與了眾多的生物學(xué)過程，如細(xì)胞的增殖分化和凋亡、個(gè)體發(fā)育和疾病的發(fā)生發(fā)展?，F(xiàn)有的研究表明MiRNAs同樣參與了免疫系統(tǒng)的各種細(xì)胞的分化發(fā)育。為進(jìn)一步探討miRNAs在淋巴細(xì)胞發(fā)育和活化中的作用，我們首先初步研究在部分淋巴細(xì)胞（monocytes、proB細(xì)胞、T細(xì)胞等）中miRNAs的表達(dá)差異。

2、結(jié)果發(fā)現(xiàn)在不同細(xì)胞，甚至同一種細(xì)胞的不同發(fā)育階段中，其 miRNAs的表達(dá)譜呈現(xiàn)顯著的差異。仔細(xì)分析miRNAs在不同免疫細(xì)胞中的表達(dá)譜，我們發(fā)現(xiàn)miR-128-2在DP T細(xì)胞中表達(dá)與其它檢測(cè)的細(xì)胞有非常顯著的差異。由此，在本課題中我們?cè)O(shè)想通過建立miR-128-2嵌合小鼠模型和miR-128-2轉(zhuǎn)基因小鼠模型來進(jìn)一步研究miR-128-2在淋巴細(xì)胞分化發(fā)育中的作用。為此，首先我們通過 q-PCR和流式分析鑒定miR-128-2過表達(dá)

3、的質(zhì)粒pmscv-GW-Rfa-eGFP-miR-128-2能成功表達(dá)miR-128-2。在此基礎(chǔ)上，為更好的研究miR-128-2對(duì)淋巴細(xì)胞發(fā)育的影響，我們一方面通過制備miR-128-2的逆轉(zhuǎn)錄病毒，感染骨髓干細(xì)胞，并建立miR-128-2過表達(dá)嵌合小鼠模型，通過FACS和PCR檢測(cè)證明我們的嵌合小鼠模型成功建立。另一方面，為得到更好的穩(wěn)定的研究模型，我們將pmscv-GW-Rfa-eGFP-miR-128-2用ScaI酶切線性化，

4、并應(yīng)用顯微注射受精卵細(xì)胞制備miR-128-2轉(zhuǎn)基因小鼠模型，經(jīng)PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，我們得到5只miR-128-2陽性小鼠模型。同時(shí)，我們通過構(gòu)建miR-128-2的海綿 miRNAs表達(dá)質(zhì)粒（pMDH-PGK-GFP-miR-128-2-sponge），并建立miR-128-2-sponge嵌合小鼠和轉(zhuǎn)基因小鼠模型，觀察阻滯miR-128-2的表達(dá)對(duì)淋巴細(xì)胞發(fā)育的影響。進(jìn)一步通過FACS分析發(fā)現(xiàn)：不管在嵌合小鼠中，還是在轉(zhuǎn)基因小鼠模型中，

5、我們均發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-128-2后，其T細(xì)胞及各種T細(xì)胞亞群的比例和其在正常小鼠中發(fā)育無顯著差異。但我們發(fā)現(xiàn)在過表達(dá)嵌合小鼠和轉(zhuǎn)基因小鼠中，不管是在骨髓還是在外周的脾臟中，均出現(xiàn) B細(xì)胞的顯著減少。而miR-128-2-sponge的嵌合小鼠和轉(zhuǎn)基因小鼠 B細(xì)胞比例輕度升高。由此我們認(rèn)為miR-128-2在造血細(xì)胞的發(fā)育中主要影響了B細(xì)胞發(fā)育，且呈現(xiàn)為對(duì)B細(xì)胞的發(fā)育阻滯作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá) miR-128-2后，并不影響B(tài)細(xì)胞的

6、自我更新和凋亡，而是通過阻滯CLP向PreProB發(fā)育來實(shí)現(xiàn)的。最后，我們通過軟件分析和PCR、熒光素酶素報(bào)告系統(tǒng)等預(yù)測(cè)miR-128-2在B細(xì)胞發(fā)育阻滯中的作用機(jī)制，初步發(fā)現(xiàn)，miR-128-2可能通過作用于多種基因如 BCL11a、MALT、A2b等來調(diào)控B細(xì)胞的發(fā)育。其詳細(xì)機(jī)制有待我們進(jìn)一步探討。
　　總結(jié)我們現(xiàn)有的研究，我們成功建立了miR-128-2過表達(dá)嵌合小鼠和轉(zhuǎn)基因小鼠動(dòng)物模型，及 miR-128-2-sponge