分子嵌合MHC-I基因小鼠骨髓造血干細胞模型的建立及體外實驗研究.pdf

1、目的:構(gòu)建分子嵌合造血干細胞,體外探討它對T細胞增殖能力的影響,為研究分子嵌合誘導移植免疫耐受奠定基礎(chǔ)。
　　 方法:①采用RT-PCR方法獲取供體C57BL/6小鼠MHC-Ⅰ基因H-2Db,通過雙酶切、定向克隆技術(shù)將H-2Db亞克隆入逆轉(zhuǎn)錄病毒表達質(zhì)粒pMSCVneo,通過Lipofectamine2000與輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞以獲得攜帶H-2Db基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒。②應用淋巴細胞分離液密度梯度分離法分選受體BALB/

2、c小鼠骨髓造血干細胞。③將攜帶H-2Db的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染造血干細胞并優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件,同時設置未轉(zhuǎn)染組,轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組；以熒光實時定量PCR和流式細胞術(shù)分別在mRNA水平和蛋白水平檢測轉(zhuǎn)染后各組造血干細胞H-2Db表達情況。④受體BALB/c小鼠輸注造血干細胞后7天,取脾細胞做為反應細胞,與來自供體C57BL/6小鼠脾細胞的刺激細胞行單向混合淋巴細胞培養(yǎng),MTT法檢測各組T細胞增殖情況。
　　 結(jié)果:①成功獲取H-2Db基因,構(gòu)建的質(zhì)

3、粒pMSCVneo-H-2Db經(jīng)限制性雙酶切檢測和測序分析,結(jié)果表明質(zhì)粒構(gòu)建成功。②質(zhì)粒pMSCVneo-H-2Db經(jīng)包裝后,獲得了攜帶H-2Db基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒。③成功體外分選及培養(yǎng)受體BALB/c小鼠骨髓造血干細胞,經(jīng)流式細胞術(shù)檢測CD34陽性細胞可達(35.60±2.19)％。④與未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組相比,轉(zhuǎn)染構(gòu)建質(zhì)粒組H-2Db基因mRNA水平和蛋白水平表達均顯著升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；而未轉(zhuǎn)染組與轉(zhuǎn)染空質(zhì)

4、粒組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。⑤單向混合淋巴細胞培養(yǎng)顯示,轉(zhuǎn)染構(gòu)建質(zhì)粒組刺激指數(shù)較未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組明顯降低(P<0.01),差異有統(tǒng)計學意義；而未轉(zhuǎn)染組與轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組之間刺激指數(shù)差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　 結(jié)論:①淋巴細胞分離液密度梯度分離法可成功從小鼠骨髓細胞中分離造血干細胞。②攜帶H-2Db基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可高效穩(wěn)定轉(zhuǎn)染受體BALB/c小鼠骨髓造血干細胞,且感染后H-2Db基因可穩(wěn)定表達。