基因改造骨髓造血干細(xì)胞靶向抑制結(jié)直腸癌新生血管形成的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分：
　　目的：構(gòu)建含有Tie2基因啟動(dòng)子增強(qiáng)子以及同時(shí)含有內(nèi)皮抑素基因的重組慢病毒質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染小鼠骨髓造血干細(xì)胞。
　　方法：從小鼠的肝臟中提取小鼠Tie2基因啟動(dòng)子與增強(qiáng)子，進(jìn)行鑒定，將之克隆到轉(zhuǎn)移質(zhì)粒載體pGL-3basic中，然后轉(zhuǎn)入慢病毒質(zhì)粒TG005。繼續(xù)將獲贈(zèng)的內(nèi)皮抑素ES基因轉(zhuǎn)入改裝過的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒載體pGL-3basic-Tie2p/e，構(gòu)建pGL-3basic-Tie2p/e-ES。同樣轉(zhuǎn)化入慢病毒質(zhì)粒T

2、G005。都通過293T細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)重組后獲得TG005-Tie2p/e和TG005-Tie2p/e-ES。采用PCR的方法對(duì)完成重組的慢病毒質(zhì)粒進(jìn)行鑒定。從小鼠骨髓中提取造血干細(xì)胞，進(jìn)行篩選，將獲取的Lin一骨髓造血干細(xì)胞用構(gòu)建的慢病毒進(jìn)行轉(zhuǎn)染，篩選轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞并鑒定細(xì)胞內(nèi)的ES產(chǎn)物。
　　結(jié)果：從小鼠的肝臟成功獲得了Tie2基因的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子，克隆入慢病毒質(zhì)粒載體后，也成功的酶切鑒定。獲贈(zèng)的ES基因也成功克隆并轉(zhuǎn)入了慢病

3、毒質(zhì)粒后酶切鑒定。PCR方法證實(shí)該慢病毒質(zhì)粒改造完成。提取了骨髓造血干細(xì)胞后進(jìn)行了篩選，篩選后轉(zhuǎn)染了相應(yīng)的病毒并表達(dá)了ES。
　　結(jié)論：慢病毒質(zhì)粒載體是一種高效、簡(jiǎn)便、快捷的病毒載體，能有效的感染細(xì)胞，轉(zhuǎn)入并表達(dá)相應(yīng)的目的基因。
　　第二部分：
　　目的：評(píng)估攜帶了Tie2基因啟動(dòng)子和增強(qiáng)子以及內(nèi)皮抑素基因的骨髓造血干細(xì)胞在抑制結(jié)直腸癌動(dòng)物模型血管新生和腫瘤增殖中的作用。
　　方法：Lovo結(jié)直腸癌細(xì)胞株建立裸鼠

4、結(jié)直腸癌模型后，40只裸鼠分為NS、HSC、慢病毒、Tie2和ES共5組，每組8只。每組分別在尾靜脈給予相應(yīng)的治療。治療期間定期測(cè)量腫瘤的體積。治療結(jié)束后，取腫瘤組織進(jìn)行體積重量測(cè)定，Ⅷ因子和Tunel染色評(píng)價(jià)腫瘤內(nèi)血管和凋亡細(xì)胞的多少。電鏡觀察血管形態(tài)并觀察其他臟器的血管形成情況。
　　結(jié)果：各個(gè)實(shí)驗(yàn)組之間在治療開始時(shí)，腫瘤體積無明顯差異(p=0.5)。在治療終止期，Tie2組的腫瘤比ES組明顯增大(P<0.01)。微血管計(jì)數(shù)的