異種抗原α-gal聯(lián)合免疫細胞治療結(jié)直腸癌的實驗研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、α-gal表位是廣泛存在于非靈長類哺乳動物細胞表面的碳水化合物結(jié)構(gòu),由GGTA1基因編碼的α1,3GT酶催化形成,能夠與anti-Gal抗體特異性結(jié)合。由于物種進化,人類細胞不表達α-gal表位,但血清中存在天然anti-Gal抗體。α-gal/anti-Gal在物種間的表達差異為抗腫瘤治療開拓了思路,其介導(dǎo)的抗腫瘤免疫治療療效已在黑色素瘤、胰腺癌等動物模型中得到驗證,也為結(jié)直腸癌免疫治療提供了新策略。然而,已被應(yīng)用于臨床試驗的α-ga

2、l糖脂的治療效果良莠不齊,原因在于該療法主要依賴患者體內(nèi)潛在的免疫系統(tǒng)功能,但腫瘤患者體內(nèi)DC細胞和T細胞功能不足,不能激發(fā)有效的抗腫瘤免疫應(yīng)答。近年,免疫細胞過繼轉(zhuǎn)移治療取得長足進展。筆者認為α-gal可聯(lián)合細胞免疫治療提高抗腫瘤療效。一方面,可利用α-gal袁住提高腫瘤免疫原性,誘導(dǎo)新型特異性DC-CTL疫苗,重建患者免疫功能;另一方面,可通過“病毒-基因”療法誘導(dǎo)自體腫瘤組織表達α-gal表位,轉(zhuǎn)變?yōu)樽泽w瘤苗,為DC-CTL疫苗提

3、供體內(nèi)治療的靶點,在識別、提呈和效應(yīng)多個環(huán)節(jié)增強抗腫瘤免疫應(yīng)答效果。
  目的:1)通過誘導(dǎo)腫瘤細胞或組織表達α-gal表位來解決腫瘤抗原免疫原性低的難題,為啟動抗腫瘤免疫應(yīng)答奠定基礎(chǔ)。2)研發(fā)新型特異性DC-CTL疫苗,為增強細胞過繼轉(zhuǎn)移治療的療效奠定基礎(chǔ)。3)初步探討工程化α-gal瘤苗聯(lián)合新型DC-CTL疫苗治療結(jié)直腸癌的可行性和治療策略,為進一步完成臨床前研究和臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
  方法:1)通過質(zhì)粒重組、病毒包裝

4、構(gòu)建調(diào)控GGTA1基因表達的實驗慢病毒Lenti-GGTA1和對照空轉(zhuǎn)病毒Lenti-control,體外感染人結(jié)腸癌細胞SW620和人胃癌細胞BGC823,建立穩(wěn)定表達α-gal表位的細胞瘤苗,Western Blot鑒定基因表達產(chǎn)物,熒光顯微鏡觀察α-gal表位的定位表達情況,流式細胞術(shù)檢測陽性表達率。2)通過質(zhì)粒重組、病毒包裝構(gòu)建E2F-1啟動子調(diào)控GGTA1基因表達的AAV-GGTA1和對照空轉(zhuǎn)病毒AAV-control,同時建

5、立裸鼠荷人結(jié)腸癌皮下移植瘤模型,瘤內(nèi)多點注射AAV-GGTA1,并以AAV-control和PBS作為對照,Western Blot鑒定腫瘤組織內(nèi)融合蛋白表達,冰凍切片間接免疫熒光染色觀察α-gal袁位表達。3)取健康人外周血分離PBMC培養(yǎng)DC和CTL,分別用普通結(jié)腸癌細胞抗原(SW620-normal)、對照慢病毒感染后的結(jié)腸癌細胞抗原(SW620-control)和α-gal修飾的結(jié)腸癌瘤苗抗原(SW620-α-gal)致敏DC,

6、進一步激活CTL,流式細胞術(shù)檢測DC和CTL細胞表型,ELISA檢測DC分泌的IL-12、IL-10以及CTL分泌的TNF-α、IL-4,LDH釋放法檢測各組CTL的體外殺傷能力。
  結(jié)果:1)經(jīng)多次酶切、PCR和Western Blot鑒定,Lenti-GGTA1和Lenti-control構(gòu)建成功,符合實驗用滴度。以MOI200感染SW620細胞、MOI40感染BGC823細胞,成功建立人結(jié)腸癌細胞瘤苗SW620-α-gal

7、和人胃癌細胞瘤苗BGC823-α-gal。通過熒光顯微鏡可以觀察到α-gal袁位表達于細胞膜上,實驗組陽性表達率高達97%。2)經(jīng)多次酶切、PCR和測序鑒定,AAV-GGTA1和AAV-control構(gòu)建成功,滴度符合實驗需要。建立裸鼠荷人結(jié)腸癌皮下移植瘤模型成功率100%。Western Blot檢測實驗組腫瘤組織內(nèi)有融合蛋白表達,間接免疫熒光染色可以觀察到腫瘤組織中廣泛表達α-gal表位。3)α-gal修飾的結(jié)腸癌抗原致敏的DC疫苗

8、CD80和HLA-DR表達升高,CD86表達有升高趨勢,CD83表達降低,分泌IL-12增加,分泌IL-10降低,以其激活的CD8+T細胞、NKT細胞比例增加,Treg細胞比例降低,分泌TNF-α增加,體外靶向殺傷能力增強。
  結(jié)論:1)體外實驗中,所制備的慢病毒可以誘導(dǎo)人腫瘤細胞廣泛穩(wěn)定表達α-gal表位,提高腫瘤細胞免疫原性。2)體內(nèi)實驗中,所制備的AAV可以在體感染人結(jié)腸癌腫瘤組織,使其廣泛表達α-gal表位,轉(zhuǎn)變?yōu)樽泽w瘤

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