異基因造血干細胞移植后供體嵌合率檢測方法的建立以及免疫細胞供體嵌合率的動態(tài)變化研究.pdf

1、目的：異基因造血干細胞移植(allo-SCT)是目前能夠根治多種造血系統(tǒng)良惡性疾病及部分實體瘤的重要及有效的手段之一。然而，移植后的并發(fā)癥復(fù)發(fā)排斥及移植物抗宿主病(GVHD)都極大地影響了移植的臨床治療效果。有研究發(fā)現(xiàn)精確動態(tài)監(jiān)測移植后患者的供者細胞嵌合率(DC)可以早期預(yù)測GVHD或排斥復(fù)發(fā)，所以移植后檢測DC對于判斷移植物狀態(tài)及決定下一步治療方案非常重要。嵌合率的檢測經(jīng)典方法有：(1)血型；(2)紅細胞同工酶；(3)性染色體核型分析

2、；(4)HLA抗原；(5)限制性長度多態(tài)性；(6)可變串聯(lián)重復(fù)序列VNTR；(7)微衛(wèi)星重復(fù)序列STR等。大部分病例可用上述方法得到客觀的植入證明，但都存在其固有缺點。本研究的第一部分通過實時定量PCR(RQ-PCR)技術(shù)對供受者差異單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點進行檢測，建立了一種目前國內(nèi)未曾報道的定量檢測嵌合體的方法，以達到經(jīng)濟、簡便、精確的目的；第二部分重點分析了移植后早期(+7d、+14d)CD4+T細胞、自然殺傷(NK)細胞以及

3、T調(diào)節(jié)細胞(Treg cell)供者嵌合率與臨床結(jié)局關(guān)系，尤其是+7d嵌合率，希望在患者達到完全嵌合(CC)或在出現(xiàn)臨床早期事件之前找到一些預(yù)測指標，來指導(dǎo)預(yù)后、提前干預(yù)。
　　 第一部分SNP-PCR定量檢測異基因移植后嵌合率方法的建立
　　 方法：1.收集2007年4月至2009年12月長海醫(yī)院65例行異基因移植的移植前供受者及移植后患者+7d、+14d、+21d、+30d、+60d、+90d、+6m、+1年、+2年

4、等的EDTA抗凝外周血或骨髓標本共650份；2.按試劑盒鹽析法或采用DNAzol或Chelex-100試劑提取基因組DNA，分光光度計測取DNA純度，-20C凍存?zhèn)溆茫?.選取了9條不同染色體上共18個SNP位點作為備選差異SNP位點，通過定量PCR篩選出供受差異SNP位點；4.RQ-PCR擴增篩選出的供受差異SNP位點，基因GAPDH校正誤差，5個濃度梯度GAPDH質(zhì)粒建立標準曲線，最后通過公式計算出供者嵌合率(DC)；5.通過對已知

5、嵌合比例的模擬嵌合標本進行嵌合率檢測，以及同時進行XY-FISH、STR-PCR及特殊融合基因檢測來驗證方法的準確性及敏感度；6.統(tǒng)計學(xué)處理：利用SPSS11.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，相關(guān)性檢驗用直線回歸分析，批間差及批內(nèi)差采用單樣本t檢驗，檢驗水準α=0.05。
　　 結(jié)果：1.標準品擴增的17次標準曲線，平均斜率為-3.39(-3.22～-3.65)，平均截距為39.97(37.33～43.19)，相關(guān)

6、系數(shù)均大于0.995，RQ-PCR反應(yīng)體系的擴增效率接近理想水平，實驗結(jié)果可信；批間差為1.1％，批內(nèi)差為0.50％，均在可控范圍；2.內(nèi)參GAPDH及各SNP位點所構(gòu)建的質(zhì)粒擴增效率基本一致，所以最后僅利用內(nèi)參一條標準曲線來計算兩者的拷貝數(shù)；3.95.4％移植前供受者經(jīng)定量PCR反應(yīng)后均能找到相互差異的位點。其中陽性率較高的位點有S2、S7b、S10b、Sgst等；4.與模擬混合嵌合相關(guān)系數(shù)在0.99以上，可重復(fù)敏感度可達0.01％，

7、與FISH、STR-PCR結(jié)果相比，差異均沒有統(tǒng)計學(xué)意義，并且與特定白血病融合基因結(jié)果比較，供者型100％CC標本，融合基因結(jié)果均為0％，相反MC標本，融合基因均為陽性，且同一患者供者細胞的比例越少，融合基因的表達率越高。
　　 第二部分異基因移植后早期(+7d、+14d)免疫細胞供者嵌合率的預(yù)后意義
　　 方法:1.收集的標本同前，收集此65名移植患者的一般信息，包括性別、年齡、疾病種類、疾病狀態(tài)、移植前化療次數(shù)、移植

8、物來源、HLA配型、預(yù)處理強度、血型、外周血植入速度、移植后并發(fā)癥、結(jié)局、存活時間；提取基因組DNA(方法同第一部分)，-20℃凍存?zhèn)溆茫?.采用SNP-PCR方法(同第一部分)對650份標本進行嵌合率檢測，分析+7d、+14d嵌合率與移植并發(fā)癥及結(jié)局的關(guān)系；3.收集2008年7月至2009年9月長海醫(yī)院32例異基因移植后+14d、+30d、+60d、+90d、+6m、+1年等的EDTA抗凝骨髓標本共150份，收集患者的一般信息(具體內(nèi)

9、容同上)；4.免疫磁珠法分選CD3+、CD56+、CD4+CD25+細胞亞群，提取基因組DNA，-20C凍存?zhèn)溆茫?.SNP-PCR對標本行嵌合率檢測(方法同第一部分)，分析+14d各細胞亞群的嵌合率與移植并發(fā)癥及結(jié)局的關(guān)系；5.采用SPSS11.0統(tǒng)計分析軟件包進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，兩組計數(shù)資料用Fish精確概率法分析，計量資料采取t檢驗，生存分析采用Kaplan-Meier方法，檢驗水準α=0.05。
　

10、　 結(jié)論:
　　 1.SNP-PCR方法檢測嵌合率方便、準確、可靠，95.4％移植前供受者經(jīng)定量PCR反應(yīng)后均能找到相互差異的位點，適宜在中國人群推廣應(yīng)用；與模擬混合嵌合相關(guān)系數(shù)在0.99以上，可重復(fù)敏感度可達0.01％，與FISH、STR-PCR結(jié)果相比，差異均沒有統(tǒng)計學(xué)意義，與特殊融合基因結(jié)果相符；
　　 2.NRT＞14天患者的+7d平均嵌合率要低于NRT＜14d患者，但差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義，PRT同樣如此；+7天

11、嵌合率＜65％組與＞65％組的平均白細胞、血紅蛋白以及血小板計數(shù)均沒有顯著差別；+7d供體嵌合率水平與外周血象的高低無直接聯(lián)系；
　　 3.在較強預(yù)處理作用下，移植后+7d平均嵌合率即達到76.36％，+14d達到CC的患者＞50％，植入速度明顯快于報道的非清髓移植(NST)；供體T細胞植入相對緩慢，明顯慢于NK細胞；
　　 4.隨著+7d及+14d嵌合率增加，復(fù)發(fā)率逐漸降低、GVHD發(fā)生率逐漸升高；+7d嵌合率＜65％

12、組復(fù)發(fā)或排斥率顯著高于＞65％組；＞85％組GVHD發(fā)生率明顯高于＜85％組；將+14d嵌合率按85％及95％分組后，＞85％組復(fù)發(fā)率顯著降低，＞95％組總GVHD及cGVHD的發(fā)生率明顯升高；+7d嵌合率＜65％及+14d＜85％可以作為排斥或復(fù)發(fā)的預(yù)警標志，+7d嵌合率＞85％及+14d＞95％可以作為GVHD發(fā)生的預(yù)警標志；
　　 5.+14d T細胞嵌合率＜80％易于復(fù)發(fā)(P=0.024)，但其比例與GVHD的發(fā)生尚無統(tǒng)

13、計學(xué)聯(lián)系；+14d NK細胞的嵌合率與復(fù)發(fā)及GVHD的發(fā)生關(guān)系并不密切；
　　 6.可以采用磁珠分選的方法分選CD4+CD25+細胞亞群，分選成功率在90％左右，+14d CD4+CD25+嵌合率高于CD4+T細胞，則不易發(fā)生GVHD，反之則GVHD發(fā)生明顯升高，可以作為+14d達到高比例嵌合患者的補充預(yù)警標志；
　　 7.本組移植患者24個月OS為56％，+7d嵌合率在65-85％的這組患者OS明顯高于＜65％及＞85