條件化MT轉(zhuǎn)基因血管瘤小鼠模型的建立.pdf

1、目的： 構(gòu)建條件化MT轉(zhuǎn)基因載體，建立條件化MT轉(zhuǎn)基因血管瘤小鼠模型，為血管瘤的體內(nèi)試驗研究及MT基因功能研究奠定基礎(chǔ)。 材料與方法： 應(yīng)用PCR的方法從雞的基因組序列中克隆絕緣子元件，酶切、測序鑒定。RT-PCR法從小鼠腦組織內(nèi)克隆KRAB序列(NKl0基因)，酶切、測序鑒定。PCR方法克隆MT基因的ORF，酶切鑒定其序列正確。應(yīng)用可誘導(dǎo)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)Tet-on系統(tǒng)，將其調(diào)控元件和應(yīng)答元件串聯(lián)成一個載體。為

2、消除兩元件之間的相互干擾，中間插入絕緣子元件；為減輕位置效應(yīng)對轉(zhuǎn)基因表達(dá)的影響，在轉(zhuǎn)基因盒的上游亦插入一絕緣子元件；為減輕條件化轉(zhuǎn)基因載體的漏表達(dá)水平，在其中一載體插入NKl0基因。載體體外電轉(zhuǎn)化COS7細(xì)胞，半定量RT-PCR法驗證兩載體功能后，將其中一載體線性化并通過顯微注射的方法將其導(dǎo)入小鼠受精卵，獲得MT轉(zhuǎn)基因小鼠，PCR法篩選、鑒定轉(zhuǎn)基因陽性鼠。小鼠雜交傳代，獲得Fl代小鼠，強(qiáng)力霉素體外誘導(dǎo)Fl代小鼠MT基因的表達(dá)，建立轉(zhuǎn)基因

3、血管瘤小鼠模型。轉(zhuǎn)基因小鼠表型分析，分別在大體標(biāo)本、病理及分子水平研究轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。 結(jié)果： 絕緣子元件、NKl0基因、MT基因成功克隆，兩條件化MT轉(zhuǎn)基因載體成功構(gòu)建。體外研究證實，MT基因的表達(dá)受強(qiáng)力霉素的調(diào)控，但兩載體均存在不同程度目的基因漏表達(dá)，載體pHs4-VPl6NKlO-hs4-TREMT目的基因漏表達(dá)水平明顯低于載體pHs4-VPl6-Hs4-TREMT，但其誘導(dǎo)效率較低，而后者的誘導(dǎo)效率明顯高于前者，但

4、其目的基因漏表達(dá)水平高。將載體pHs4-VPl6-Hs4-FREMI、線性化后，通過原核注射的方法將其導(dǎo)入小鼠受精卵，獲得105只G0代小鼠，PCR檢測，5只為轉(zhuǎn)基因陽性(FO代)，1只在出生后3周死亡，尸檢發(fā)現(xiàn)腦部有血管瘤生成。其余4只與野生型小鼠雜交傳代，共獲得3只F1代鼠，其中2只在出生后2月出現(xiàn)血管瘤表型，2周后死亡。其余1只強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)MT基因表達(dá)，3月后在小鼠胸部皮下可見有腫物形成。處死動物，尸檢發(fā)現(xiàn)在小鼠腹部皮下、皮膚、胸