可調(diào)控肝臟特異性表達(dá)HCV全基因轉(zhuǎn)基因小鼠模型的建立.pdf

1、丙型肝炎病毒（Hepatitis CVirus，HCV）是造成慢性肝炎、肝硬化及肝癌的重要感染性因素，是全球重大公共衛(wèi)生問題之一。盡管目前在HCV生物學(xué)等方面的研究有一定進(jìn)展，但是由于缺乏有效的HCV感染小動物模型限制了對HCV感染致病機(jī)制的深入研究，進(jìn)而大大阻礙了對HCV疫苗及藥物的研發(fā)進(jìn)展。HCV病毒具有高度種屬特異性，除人類作為其感染的天然宿主外，僅能感染黑猩猩，不能自然感染其他物種，但是鑒于HCV感染黑猩猩模型并不適合于HCV慢

2、性感染及相關(guān)的HCC研究，加之倫理等方面的限制，探索建立HCV小動物模型對揭示HCV感染致病機(jī)制、HCV疫苗及治療性藥物的研發(fā)等具有深遠(yuǎn)的意義。本研究基于Tet-On可調(diào)控真核表達(dá)系統(tǒng)，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)，構(gòu)建可調(diào)控肝組織特異性表達(dá)HCV全基因組的轉(zhuǎn)基因小鼠模型，并從基因水平、HCV RNA水平，蛋白表達(dá)水平及藥物評價方面對該轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行驗證。證實該轉(zhuǎn)基因小鼠模型在HCV感染致病機(jī)制研究、HCV病毒疫苗及藥物研發(fā)評價等方面的具有重要的應(yīng)用

3、價值。
　　1.Tet-On-Alb-HCV雙轉(zhuǎn)基因小鼠的制備
　　以復(fù)制子模型pUC19-HCV質(zhì)粒為模板，設(shè)計引物，通過PCR技術(shù)首先將位于9.6kb的HCV基因組5'端的原核啟動子T7去除;且在HCV基因組3'末端添加HDV核酶序列ribo，目的在于利用核酶具有的在DNA及RNA水平的自剪切特性，實現(xiàn)HCV全基因在宿主基因組中的自剪切。將改構(gòu)后的HCV基因組包括3'末端的HDV核酶序列連于Tet-On系統(tǒng)中的反應(yīng)性元件

4、pTRE2載體多克隆位點(diǎn)，從而構(gòu)建pTRE2-HCV-ribo質(zhì)粒。為了驗證該系統(tǒng)中HCV的可調(diào)控表達(dá)，將構(gòu)建好的pTRE2-HCV-ribo質(zhì)粒與本研究室前期已構(gòu)建的受小鼠肝組織特異性表達(dá)白蛋白的啟動子Alb調(diào)控的融合轉(zhuǎn)錄活化因子質(zhì)粒（pAlb-rtAT）共轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞，免疫熒光實驗檢測其HCV核心抗原的表達(dá)。研究結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)染pTRE2-HCV-ribo和pAlb-rtAT的Huh7細(xì)胞在強(qiáng)力霉素(DOX)誘導(dǎo)下，可見HCV核

5、心蛋白較高水平的表達(dá)，而DOX未誘導(dǎo)組未見表達(dá)。該研究結(jié)果表明，本研究建立的Tet-On-Alb-HCV系統(tǒng)可以實現(xiàn)小鼠白蛋白啟動子對HCV表達(dá)的有效調(diào)控。
　　基于以上研究基礎(chǔ)，將載體pTRE2-HCV-ribo質(zhì)粒線性化后，顯微注射C57BL/6J小鼠受精卵，獲得TRE2-HCV轉(zhuǎn)基因小鼠。將其與本研究室制備的含有肝特異性白蛋白啟動子Alb的rtAT轉(zhuǎn)基因小鼠（Alb-rtAT轉(zhuǎn)基因小鼠）進(jìn)行雜交，通過PCR鑒定篩選得到同時整

6、合有Alb及HCV基因的Tet-On-Alb-HCV雙轉(zhuǎn)基因小鼠。通過雜交及多代自交繁育，獲得相對穩(wěn)定的Tet-On-Alb-HCV雙轉(zhuǎn)基因小鼠。
　　2.Tet-On-Alb-HCV雙轉(zhuǎn)基因小鼠的表達(dá)鑒定
　　為了驗證Tet-On-Alb-HCV轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)HCV的可調(diào)控表達(dá)，在Alb及HCV雙轉(zhuǎn)基因鑒定為陽性的基礎(chǔ)上，對Tet-On-Alb-HCV雙轉(zhuǎn)基因小鼠的HCVRNA、HCV蛋白表達(dá)進(jìn)行鑒定，并通過分析HCV治療

7、性藥物的作用效果驗證該雙轉(zhuǎn)基因小鼠模型的成功建立。
　　利用實時定量PCR技術(shù)，對DOX誘導(dǎo)下的雙轉(zhuǎn)基因小鼠肝組織及血清中的HCV RNA水平進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示其肝組織中有較高的HCV表達(dá)，血清中HCVRNA可達(dá)105copies/ml，且可持續(xù)12周以上。通過Western Blot對該小鼠各主要臟器進(jìn)行HCV核心抗原的檢測，結(jié)果顯示HCV核心抗原在肝組織特異性表達(dá)，其他組織均無HCV表達(dá);免疫組化實驗進(jìn)一步驗證了轉(zhuǎn)基因小鼠肝組

8、織中HCV核心抗原，E2蛋白及非結(jié)構(gòu)蛋白NS5蛋白的表達(dá)。利用HCV小分子藥物anti-MicroRNA122對誘導(dǎo)后小鼠進(jìn)行藥物治療，結(jié)果顯示anti-MicroRNA122治療后小鼠血清中HCV RNA水平顯著下降。
　　以上研究結(jié)果表明我們建立的雙轉(zhuǎn)基因小鼠可實現(xiàn)HCV全基因的可調(diào)控表達(dá)，并應(yīng)用于HCV的藥物等評價研究。
　　3.結(jié)論
　　本研究成功構(gòu)建了一種基于Tet-On系統(tǒng)的可調(diào)控肝特異性表達(dá)HCV全基因轉(zhuǎn)