平滑肌細(xì)胞特異性Smad4基因敲除小鼠的建立.pdf

1、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)是TGF-β超家族的成員，包括TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3。TGF-βs通過(guò)細(xì)胞膜上的Ⅰ型和Ⅱ型受體活化細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子Smads而實(shí)現(xiàn)其廣泛的功能，Smad4是TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的核心樞紐分子，它與受體依賴的Smads結(jié)合調(diào)節(jié)下游靶基因的表達(dá)。大量的研究顯示它在心血管疾病中發(fā)揮著重要的作用。本研究的目的是利用Cre/LoxP系統(tǒng)建立

2、平滑肌細(xì)胞特異性Smad4基因敲除小鼠并進(jìn)行初步表型分析，期望獲得一種可用于研究TGF-β在心血管疾病中的作用機(jī)制的動(dòng)物模型以及建立一種分離原代平滑肌細(xì)胞的方法，為從基因敲除小鼠體內(nèi)獲得原代平滑肌細(xì)胞并在體外研究TGF-β對(duì)其功能影響提供技術(shù)手段。
　　 本研究選擇了平滑肌細(xì)胞特異性表達(dá)Cre重組酶的轉(zhuǎn)基因小鼠(SMA-Cre)作為介導(dǎo)敲除的工具鼠，將其與ROSA26報(bào)告基因小鼠交配獲得了SMA-Cre；ROSA26雙轉(zhuǎn)基因小鼠

3、，通過(guò)LacZ染色顯示在其主動(dòng)脈壁的平滑肌細(xì)胞有特異性藍(lán)染，說(shuō)明SMA-Cre能在血管平滑肌細(xì)胞中特異的表達(dá)。接著用SMA-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠與Smad4條件基因打靶小鼠交配獲得了在平滑肌細(xì)胞特異性Smad4基因敲除小鼠，通過(guò)擴(kuò)增Smad4剔除條帶和原位免疫熒光顯示敲除小鼠中Smad4發(fā)生了敲除。Smad4基因敲除小鼠無(wú)胚胎致死，能夠順利出生，大約70％的基因敲除小鼠在6-8周齡死亡。Smad4基因敲除小鼠在6周的時(shí)候出現(xiàn)腹主動(dòng)脈瘤。本研

4、究用膠原酶消化法分離小鼠原代平滑肌細(xì)胞，免疫熒光鑒定此方法獲得的平滑肌細(xì)胞。用這種方法分離平滑肌細(xì)胞特異性Smad4基因敲除小鼠的主動(dòng)脈的原代平滑肌細(xì)胞，用免疫熒光，Western blot及Real-time PCR檢測(cè)了敲除小鼠來(lái)源的原代平滑肌細(xì)胞中Smad4的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)分離出來(lái)的原代平滑肌細(xì)胞獲得了穩(wěn)定遺傳的Smad4敲除。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示本研究成功建立了平滑肌細(xì)胞特異性Smad4基因敲除小鼠并能自發(fā)形成腹主動(dòng)脈瘤。建