生長停滯特異性蛋白-6對血管平滑肌細(xì)胞衰老影響的研究.pdf

1、研究背景：衰老是身體機(jī)能、適應(yīng)性以及抵抗力隨著時間的推移而逐漸降低的一種現(xiàn)象?，F(xiàn)如今，隨著全球人口老齡化步伐的加快，衰老正逐步成為全球關(guān)注的焦點:由于衰老與人類的壽命以及生活質(zhì)量關(guān)系密切，因此，能否延緩衰老對于提高人們的生活質(zhì)量以及延長壽命尤為重要。研究顯示，衰老逐步成為心血管系統(tǒng)的首要危險因素:衰老可以影響心血管系統(tǒng)的代謝并因此導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)的代謝紊亂、異常的細(xì)胞死亡以及炎癥的發(fā)生;從而使心血管系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，最終導(dǎo)致心血管

2、重構(gòu)。
　　Growth arrest-specific protein6(Gas6)是由growth arrest-specific gene6（gas6）基因所編碼的一種分泌型蛋白，隸屬于維生素K依賴性蛋白家族成員。多項研究顯示Gas6/Axl信號參與血管鈣化、血管重塑以及動脈粥樣硬化等病理生理過程。此外，基因多態(tài)性分析顯示，gas6基因與急性冠脈綜合征以及中風(fēng)關(guān)系密切。
　　根據(jù)上述觀點和理論可以推斷:Gas6/Axl

3、信號與心血管系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展具有重要的理論和實際意義。然而，Gas6/Axl信號對心血管系統(tǒng)衰老的影響以及具體的作用機(jī)制尚不明確。因此，本研究將對Gas6/Axl信號對血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)衰老的影響進(jìn)行研究探討。
　　目的：
　　1.探討Gas6對細(xì)胞衰老的影響
　　2.探討Gas6對細(xì)胞衰老影響下的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路
　　3.探討Gas6參與細(xì)胞衰老調(diào)節(jié)

4、的具體作用機(jī)制
　　方法：
　　本研究以MOVAS小鼠主動脈平滑肌細(xì)胞系及原代培養(yǎng)的小鼠主動脈平滑肌細(xì)胞為研究對象，應(yīng)用蛋白免疫印跡(Western Blotting)、衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶染色(Senescence-associatedβ-galactosidase staining，SA-β-Gal)、流式細(xì)胞術(shù)(Flowcytometry)、細(xì)胞轉(zhuǎn)染小干擾RNA(si-RNA)、以及EdU熒光標(biāo)記法等實驗方法，分別觀

5、察以下指標(biāo):
　　1.細(xì)胞衰老模型的建立以及鑒定情況。
　　2.使用多個濃度梯度的Gas6蛋白刺激原代細(xì)胞，通過檢測p16INK4a和p21Cip1蛋白表達(dá)情況以及β-半乳糖苷酶染色率情況，得出Gas6刺激的最佳時間點以及最適濃度。
　　3.給予細(xì)胞重組游離型Axl蛋白(Axl-Fc)刺激，用以中和細(xì)胞上清中的Gas6，降低其上清中的濃度。進(jìn)一步檢測細(xì)胞p16INK4a和p21Cip1衰老相關(guān)蛋白表達(dá)情況以及β-半乳糖

6、苷酶染色率的情況。
　　4.使用Axl特異性阻斷劑R428干預(yù)細(xì)胞，觀察細(xì)胞的衰老情況。
　　5.使用流式細(xì)胞技術(shù)和EdU標(biāo)記法分別檢測細(xì)胞周期和細(xì)胞增殖情況，分析以上六組細(xì)胞周期分布情況以及細(xì)胞增殖變化。
　　6.分別使用Axl和磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphatidylinositol3-kinase，PI3K)的特異性阻斷劑R428和LY294002刺激兩個衰老模型的細(xì)胞，分別觀察下游分子PI3K、Akt、Fo

7、xO3a、p27Kip1和cyclin E以及Akt、FoxO3a、p27Kip1和cyclin E表達(dá)改變情況。
　　7.使用設(shè)計、化學(xué)合成FoxO3a siRNA，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染MOVAS細(xì)胞系，以抑制FoxO3a的合成和表達(dá)，觀察FoxO3a對細(xì)胞周期的影響。
　　結(jié)果：
　　1.衰老模型的鑒定
　　衰老相關(guān)β半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色和Western Blotting結(jié)果顯示，當(dāng)原代VSMC傳至第

8、10代時，細(xì)胞SA-β-Gal染色率可達(dá)80％以上，較對照組明顯增加（P＜0.001）;另外，衰老相關(guān)分子指標(biāo)p16INK4a和p21 Cip1較對照組（第3代）明顯增加(P＜0.001，P＜0.001)。
　　我們選用第4代原代VSMC，使用1*10-6 mol/L濃度的血管緊張素II連續(xù)刺激48小時后的細(xì)胞作為誘導(dǎo)衰老模型(Induced Senescence，IS)。2.Gas6延緩細(xì)胞的衰老過程
　　分別使用多個濃度

9、梯度和時間點的Gas6刺激細(xì)胞，通過Western blotting，發(fā)現(xiàn)使用250 ng/mL的Gas6連續(xù)刺激細(xì)胞36小時，衰老相關(guān)分子指標(biāo)p16INK4a和p21Cip1較對照組明顯降低(P＜0.05，P＜0.001)。
　　3.Axl是介導(dǎo)Gas6發(fā)揮抗衰老作用的主要受體
　　在給與細(xì)胞R428刺激后，無論是否給予Gas6干預(yù)，p16INK4a和p21Cip1的蛋白表達(dá)水平以及SA-β-Gal染色率明顯高于未給予R4

10、28刺激組(P＜0.001，P＜0.001，P＜0.01)。而這兩組細(xì)胞的p16INK4a和p21Cip1的蛋白表達(dá)水平以及SA-β-Gal染色率水平卻無明顯差異。
　　4.Gas6促進(jìn)細(xì)胞G1/S期的轉(zhuǎn)位并提高細(xì)胞的增殖水平
　　在兩組衰老模型細(xì)胞中，再給予Gas6干預(yù)后，細(xì)胞均顯示出G1期的降低以及S期的增加（P＜0.05，P＜0.05），而年輕組細(xì)胞在給與Gas6干預(yù)后較其對照組尚無明顯改變。
　　另外，在兩組衰

11、老模型細(xì)胞中，在給與Gas6干預(yù)后，其增殖水平均較其對照組明顯增加（P＜0.05，P＜0.05）。
　　5.PI3K/Akt/FoxO信號通路參與Gas6抗細(xì)胞衰老作用的過程
　　在誘導(dǎo)衰老模型中，給予R428干預(yù)后，PI3K、p-Akt、p-FoxO3a以及cyclinE水平較對照組明顯降低（P＜0.01，P＜0.05，P＜0.01，P＜0.05），而p27kip1水平較對照組明顯增高（P＜0.01）;在復(fù)制衰老模型中，在

12、給與細(xì)胞R428干預(yù)后，PI3K、p-Akt、p-FoxO3a以及cyclin E水平較對照組明顯降低(P＜0.01，P＜0.05，P＜0.01，P＜0.05)，而p27kip1水平較對照組明顯增高(P＜0.01)。
　　另外，我們使用PI3K的特異性阻斷劑LY294002干預(yù)后，檢測其下游通路的變化。在誘導(dǎo)衰老模型中，給予LY294002干預(yù)后，p-Akt、p-FoxO3a以及cyclinE水平較對照組明顯降低（P＜0.05，P

13、＜0.05，P＜0.01），而p27kip1水平較對照組明顯增高（P＜0.01）;在復(fù)制衰老模型中，在給與細(xì)胞LY294002干預(yù)后，p-Akt、p-FoxO3a以及cyclinE水平較對照組明顯降低(P＜0.01，P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01)，而p27kip1水平較對照組明顯增高(P＜0.05)。
　　6.FoxO是受Gas6調(diào)節(jié)的關(guān)鍵作用因子
　　使用FoxO3a-siRNA轉(zhuǎn)染MOVAS細(xì)胞后，p27ki

14、p1表達(dá)水平明顯增高(P＜0.01)，而cyclin E表達(dá)水平明顯降低(P＜0.05);另外，通過細(xì)胞周期分析，F(xiàn)oxO3a-siRNA轉(zhuǎn)染后細(xì)胞較對照組其G1期增高而S期降低（P＜0.01）。
　　結(jié)論：
　　1.Gas6延緩細(xì)胞的衰老過程;
　　2.Axl是介導(dǎo)Gas6發(fā)揮抗衰老作用的主要受體;
　　3.Gas6促進(jìn)細(xì)胞G1/S期的轉(zhuǎn)位并提高細(xì)胞的增殖水平;
　　4.PI3K/Akt/FoxO信號通路