特異性平滑肌p27基因?qū)︻i動(dòng)脈支架術(shù)后再狹窄的影響及機(jī)制研究.pdf

1、本文主要從以下三個(gè)方面展開論述：
　　第一部分
　　目的：研究表明藥物涂層支架術(shù)后再狹窄的形成主要表現(xiàn)為內(nèi)膜增生和血管重塑，而血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs）的過度增殖在其中起到了重要作用。本研究旨在通過構(gòu)建SM22alpha-p27-EGFP重組慢病毒載體，探討SM22alpha啟動(dòng)子對(duì)VSMCs p27蛋白過表達(dá)及特異性選擇作用，選擇重組慢病毒感染細(xì)胞最適宜MOI，為慢病毒調(diào)控細(xì)胞周期機(jī)制研究提供進(jìn)一步依據(jù)。
　　方法

2、：鼠尾基因組釣取sm22alpha，構(gòu)建攜帶p27基因的慢病毒和無p27基因的對(duì)照空病毒。感染原代培養(yǎng)平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)確定病毒的選擇性感染能力及感染復(fù)數(shù)；免疫熒光法和Western Blot檢測(cè)p27基因在兩種細(xì)胞中的表達(dá)及細(xì)胞形態(tài)變化。
　　結(jié)果：1）從大鼠基因組中提取SM22alpha啟動(dòng)子，構(gòu)建 SM22alpha-p27-EGFP及SM22alpha-null-EGFP重組慢病毒，病毒滴度為5×108U/m

3、l。2）FACs示 SM22alpha啟動(dòng)子具有平滑肌細(xì)胞特異性選擇作用，選定最適MOI為103）免疫熒光染色示SM22alpha promoter-p27-EGFP病毒能夠有效過表達(dá)p27蛋白4）Western Blot提示p27蛋白過表達(dá)且證實(shí)存在重組蛋白。
　　結(jié)論：SM22alpha啟動(dòng)子介導(dǎo)的重組慢病毒載體具有平滑肌特異性選擇作用且能夠有效過量表達(dá)p27蛋白。
　　第二部分
　　目的：第一部分的研究表明，重組

4、慢病毒SM22alpha-p27-EGFP能夠選擇性感染平滑肌細(xì)胞并過表達(dá)p27蛋白。本部分研究同紫杉醇相比，重組慢病毒是否能夠通過p27的過表達(dá)有效達(dá)成細(xì)胞周期阻滯、抑制細(xì)胞增殖的作用。探討重組慢病毒和紫杉醇對(duì)細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制，為臨床DES改進(jìn)提供新的思路。
　　方法：BrdU染色分析紫杉醇與重組慢病毒對(duì)血管平滑肌細(xì)和血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力的影響。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)正常培養(yǎng)和不同藥物干預(yù)組血管內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞細(xì)胞周期分布。

5、
　　結(jié)果：BrdU結(jié)果示平滑肌細(xì)胞組中：紫杉醇與SM22alpha-p27過表達(dá)病毒均能夠有效抑制vsmc增殖（p<0.05）,其中紫杉醇與過表達(dá)病毒對(duì)于vsmc增殖的抑制更加明顯（p<0.01）；內(nèi)皮細(xì)胞組，紫杉醇能夠有效抑制 vsmc增殖（p<0.05）,但陰性對(duì)照病毒及過表達(dá)病毒抑制增殖能力并沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。流式結(jié)果示紫杉醇干預(yù)后的內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞均表現(xiàn)出G2/M期阻滯現(xiàn)象，伴隨S期分布減少，G0/G1期細(xì)胞分布減少（