血管平滑肌細(xì)胞特異性敲除SCAP減輕高膽固醇飲食誘導(dǎo)ApoE---小鼠動(dòng)脈粥樣硬化.pdf

1、目的：動(dòng)脈粥樣硬化（Atherosclerosis, AS）所致的心、腦血管病變，嚴(yán)重威脅著人們的身體健康。眾所周知，AS斑塊最主要的病理學(xué)標(biāo)志是泡沫細(xì)胞的形成，富含膽固醇等脂質(zhì)的泡沫細(xì)胞因其為表達(dá)巨噬細(xì)胞的特征性標(biāo)記，人們習(xí)慣性的認(rèn)為所有的泡沫細(xì)胞均來(lái)源于巨噬細(xì)胞，但是目前已經(jīng)證實(shí)，血管中的平滑肌細(xì)胞（VSMCs）也可以轉(zhuǎn)化成泡沫細(xì)胞。固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(Sterol Regulatory Element Binding Prote

2、in, SREBPs)裂解激活蛋白(SREBP Cleavage Activating Protein, SCAP)又被稱為膽固醇敏感器，是調(diào)控低密度脂蛋白受體（Low Density Lipoprotein Receptor, LDLr）及膽固醇內(nèi)源性合成限速酶羥甲基戊二酸單酰輔酶 A還原酶(Hydroxy Methylglutaryl Coenzyme A Reductase，HMGCoAR)表達(dá)的上游重要分子，因此SCAP在維持細(xì)

3、胞內(nèi)膽固醇濃度的穩(wěn)定中具有重要作用。為了進(jìn)一步研究 VSMCs中SCAP/SREBPs通路在AS形成過(guò)程中的作用，本實(shí)驗(yàn)擬采用Cre-Loxp系統(tǒng)制備在ApoE-/-敲除小鼠背景下血管平滑肌特異SCAP基因敲除小鼠模型進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，探討在VSMCs中SCAP-SREBPs途徑在介導(dǎo)的VSMCs泡沫細(xì)胞形成中的重要作用。
　　方法：本研究利用在VSMCs特異性表達(dá)Cre重組酶的轉(zhuǎn)基因小鼠（SM22-Cre）作為工具鼠來(lái)介導(dǎo)敲除，我們

4、將雌性SCAPflox/flox小鼠與雄性SM22-Cre+/-轉(zhuǎn)基因小鼠合籠交配，得到SM22-Cre;SCAPflox/+轉(zhuǎn)基因小鼠。為了研究SCAP在AS中的作用,本研究用SM22-Cre;SCAPflox/+轉(zhuǎn)基因小鼠與 ApoE-/-小鼠二次交配獲得 SM22-Cre;SCAPflox/+;ApoE-/-轉(zhuǎn)基因小鼠。為了確定該小鼠模型中 SCAP基因敲除的特異性和有效性，我們通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time PCR)

5、技術(shù)和免疫組化（IHC）方法檢測(cè)主動(dòng)脈中 SCAP的表達(dá)。用油紅 O染色法觀察SM22-Cre;SCAPflox/+;ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈斑塊形成情況及人 VSMCs脂質(zhì)沉積情況，酶法測(cè)定VSMCs膽固醇酯(Cholesterol Ester, CE)和游離膽固醇(Free Cholesterol, FC)的水平；應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time PCR)技術(shù)檢測(cè)小鼠主動(dòng)脈及人VSMCs LDLr、HMGCoAR、SREB

6、P2、SCAP mRNA水平的表達(dá)；用 IHC檢測(cè)小鼠主動(dòng)脈冰凍切片 LDLr、HMGCoAR、SREBP2、SCAP蛋白表達(dá)。應(yīng)用Western blotting技術(shù)檢測(cè)人 VSMCs中 LDLr、HMGCoAR、nSREBP2、SCAP蛋白表達(dá)；應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR(Real-time PCR)技術(shù)檢測(cè)小鼠主動(dòng)脈 MCP-1、IL-6、IL-1β、TNF-αmRNA表達(dá)水平，用IHC的方法檢測(cè)小鼠主動(dòng)脈冰凍切片MCP-1、IL-

7、6、IL-1β、TNF-α等蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果：1.我們利用Cre/Loxp系統(tǒng)獲得了SM22-Cre;SCAPflox/+;ApoE-/-小鼠，RT-PCR和 IHC發(fā)現(xiàn) SM22-Cre; SCAPflox/+;ApoE-/-小鼠與對(duì)照組SM22-Cre；SCAP+/+；ApoE-/-相比主動(dòng)脈VSMCs中SCAP的表達(dá)明顯減少，因此SM22-Cre；SCAP flox/+；ApoE-/-小鼠可以作為研究SCAP在VSM

8、Cs中泡沫細(xì)胞形成的良好模型。
　　2. SM22-Cre;SCAPflox/+;ApoE-/-與對(duì)照組均有明顯粥樣斑塊形成，但SM22-Cre；SCAP flox/+；ApoE-/-組小鼠AS斑塊的面積明顯減小，這一結(jié)果表明在小鼠VSMCs中特異地敲除SCAP能夠減少動(dòng)脈壁細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的蓄積。
　　3.在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了在小鼠 VSMCs中 SCAP–SREBPs–LDLr/HMGcoA-R通路蛋白的下調(diào)能夠減少 AS形成；同

9、時(shí)我們通過(guò)RNA干擾SCAP的方法在體外人原代VSMCs中得到與體內(nèi)相同的結(jié)論。
　　4. SM22-Cre；SCAP flox/+；ApoE-/-小鼠動(dòng)脈趨化因子MCP-1，炎癥因子 IL-6、IL-1β、TNF-α明顯降低，因此我們認(rèn)為 SCAP的降低也可能通過(guò)減輕動(dòng)脈組織的炎癥因子的釋放減緩了AS的發(fā)展。
　　結(jié)論：在VSMCs中特異性減少SCAP的表達(dá)能通過(guò)SCAP/SREBP通路減少細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的蓄積，同時(shí) SCAP