兩種木賊提取物對動脈粥樣硬化早期大鼠血管平滑肌細胞的影響.pdf

1、目的：前期實驗研究證實中藥木賊水煎劑具有調(diào)節(jié)脂代謝紊亂，保護血管內(nèi)皮，改善動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)早期病變的作用。本實驗在前期實驗的基礎(chǔ)上，對木賊抗AS的有效部位進行提取，通過動物實驗，研究兩種提取物對AS早期大鼠血脂、主動脈血管平滑肌細胞(vascularsmooth muscle cell．VSMC)增殖、凋亡、凋亡相關(guān)基因的蛋白表達及血管壁形態(tài)學(xué)的影響。旨在探討木賊抗AS的有效部位及其作用機制。

2、 方法 1 木賊有效部位的提取、分離中藥木賊用蒸餾水1:100，加熱3小時，回流提取得木賊水煎劑，水煎劑用正丁醇萃取，正丁醇萃取液加熱回收至干，用蒸餾水定容至1.25g/ml生藥備用。萃取后剩余部分濃縮至濃度為1.25g/ml生藥備用。 2 動物實驗 選用健康成年雄性Sprague-DaWley(SD)大鼠，實驗鼠50只，備用鼠10只，共60只。隨機分為5組：正常對照組、病理模型組、陽性對照組、木賊提取物I

3、組和木賊提取物II組，每組10只。實驗第1周起，除正常對照組大鼠給予基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，其余4組分別給予高脂飼料喂養(yǎng)(87.48％基礎(chǔ)飼料+10％豬油+2％膽固醇+0.5％膽鹽+0.02％他巴唑)，各組動物自由飲水。造模同時，陽性對照組用0.16g/(kg·d)吉非羅齊溶液灌胃；木賊提取物I組以木賊的正丁醇提取物10ml/(kg·d)(合生藥12.5g/kg·d)灌胃；木賊提取物Ⅱ組以提取剩余物10ml/(kg·d)(合生藥12.5g/kg·

4、d)灌胃；正常對照組及病理模型組分別給予等量自來水灌胃，隨體重增長調(diào)節(jié)藥量，共9周。除實驗組大鼠外，每組各增加2只備用鼠，同樣方法復(fù)制模型，給藥，作為實驗中大鼠中途死亡的補救。 3 指標檢測9周末眶后取血，全自動生化分析儀檢測血脂水平；流式細胞術(shù)檢測VSMC增殖周期、增殖指數(shù)、凋亡相關(guān)基因的蛋白表達、凋亡率；取主動脈分別以光鏡及電鏡觀察血管壁變化。 結(jié)果 1 實驗大鼠一般狀況正常組大鼠毛色光澤，活動飲食正常；病理模型組

5、大鼠隨實驗進程，毛發(fā)色澤暗淡，活動減少，精神萎靡，易激惹，后期進食量減少；陽性對照組、木賊提取物I組和木賊提取物Ⅱ組大鼠一般情況好于模型組。 2 血脂的變化病理模型組膽固醇(total ch01esterol，TC)、低密度脂蛋白(10w density lipoprotein，LDL)較正常組明顯升高(P<0.01)，甘油三酯(triglyceride，TG)、極低密度脂蛋白(very 10w density lipopro

6、tein，VU)L)輕度升高，但無統(tǒng)計學(xué)意義；木賊提取物I組TG、VLDL較病理模型組明顯下降(P<0.01)；木賊提取物Ⅱ組TG顯著下降(P<0.01)，VLDL減少(P<0.05)，高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)上升(P<0.01)。 3 VSMC增殖周期、增殖指數(shù)的變化模型組處于G<,0>/G<,1>期的VSMC百分比較正常組明顯減少，S期和G2M期的細胞增多(P<0.01)；木賊

7、提取物I組、Ⅱ組的G<,0>/G<,1>期細胞較模型組顯著升高(P<0.01)，S期細胞百分比則明顯降低(P<0.01)，G<,2>M期細胞百分比亦有不同程度降低；模型組VSMC增殖指數(shù)較正常組增高(P<0.01)；木賊提取物I組和木賊提取物Ⅱ組增殖指數(shù)較模型組顯著下降(P<0.01)。 4 VSMC凋亡相關(guān)基因的蛋白表達、凋亡率的變化病理模型組VSMC的Fas蛋白表達輕度升高，但無統(tǒng)計學(xué)意義，突變型p 53、Caspase-

8、3較正常組表達升高(P<0.01)，Bcl-2下降(P<0.01)，凋亡率增高(P<0.01)；木賊提取物I組和木賊提取物Ⅱ組Fas蛋白表達明顯高于病理模型組(P<0.01)；突變型p 53蛋白減少(P<0.01)，其中木賊提取物I組較木賊提取物Ⅱ組下降明顯(P<0.01)；Bcl-2蛋白減少(P<0.01)：Caspase-3蛋白升高(P<0.01)；木賊提取物I組和木賊提取物Ⅱ組VSMC的凋亡率較模型組顯著升高(P<0.01)；木賊

9、提取物I組較木賊提取物Ⅱ組凋亡率增加更為明顯(P<0.01)。 5 主動脈形態(tài)學(xué)改變 5.1肉眼觀察正常組大鼠血管內(nèi)膜光滑，管壁有彈性；病理模型組大鼠血管內(nèi)膜面光澤度下降，管壁彈性稍差；陽性對照組及兩種木賊提取物組大鼠與正常組相近。 5．2光鏡觀察正常組血管內(nèi)膜光滑，完整，中膜VSMC走行規(guī)律，未見增生。病理模型組血管內(nèi)膜嚴重損傷，內(nèi)膜層可見大量VSMC，中膜VSMC數(shù)目也明顯增多，排列紊亂，細胞間基質(zhì)豐富。

10、木賊提取物I組和木賊提取物Ⅱ組血管內(nèi)皮局部損傷，中膜VSMC可見少量遷徙增生，但較病理模型組明顯減輕，且木賊提取物I組優(yōu)于木賊提取物Ⅱ組。 5．3透射電鏡觀察正常組主動脈VSMC外形正常，細胞核呈輕度扭曲狀，核仁較大，肌絲豐富；病理模型組VSMC高度變形，核分裂，核仁肥大。細胞器增多，肌絲減少，胞質(zhì)中可見吞噬的脂滴，間質(zhì)纖維增生；兩組提取物與病理模型組相比，VSMC變形程度明顯變小，胞體及胞核體積減小，細胞器減少，胞質(zhì)中未見異常