以血管平滑肌細(xì)胞為靶標(biāo)的抗動(dòng)脈粥樣硬化功效成分篩選及其作用機(jī)制初探.pdf

1、血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)的異常增殖、遷移是引起心血管疾病的關(guān)鍵因素之一。抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖,維持血管功能正常,是進(jìn)行血管疾病預(yù)防的重要措施之一。本課題以本實(shí)驗(yàn)室獲得的體外培養(yǎng)人臍動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞,并以高濃度血清刺激細(xì)胞增殖建立其異常增殖模型,以傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中具有治療“血瘀”效果的多種天然產(chǎn)物的活性成分如女貞子的齊墩果酸、當(dāng)歸的阿魏酸、決明子的1,8-二羥基蒽醌及山藥的薯蕷皂苷元和大豆苷元及其衍生物等為研究對(duì)象,觀察其活性成分對(duì)于

2、血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移與粘附等細(xì)胞行為的影響變化,并初步探索了其影響機(jī)制。
　　 用組織植塊貼壁法進(jìn)行人臍動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞的體外原代和傳代培養(yǎng)。倒置相差顯微鏡觀察血管平滑肌細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài),確定其生長(zhǎng)曲線,考馬斯亮藍(lán)R250染色觀察細(xì)胞形態(tài)。結(jié)果原代培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)三到四周的貼壁生長(zhǎng)后遷移出植塊并鋪滿瓶底,生長(zhǎng)狀態(tài)良好,在光鏡下觀察單個(gè)細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形,細(xì)胞束狀排列,呈現(xiàn)漩渦狀生長(zhǎng),生長(zhǎng)匯合呈典型的“峰-谷”樣,具有典型的平滑肌細(xì)胞特征

3、。經(jīng)傳代培養(yǎng)至第5代,細(xì)胞生長(zhǎng)特性未見異常改變。表明成功建立了人臍動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞系。
　　 以高濃度血清培養(yǎng)VSMC,刺激細(xì)胞增殖生長(zhǎng),建立了VSMC的增殖模型。結(jié)果顯示:高濃度血清培養(yǎng)VSMC引起單位面積內(nèi)細(xì)胞族簇生長(zhǎng),細(xì)胞數(shù)量顯著增加,細(xì)胞達(dá)1.02×106個(gè),而未增殖的對(duì)照組為6.7×105個(gè)；細(xì)胞核染色明顯,反差增強(qiáng)；細(xì)胞總蛋白含量由對(duì)照組的6.216μg升高至10.964μg；BrdU對(duì)細(xì)胞DNA的摻入量由對(duì)照組的

4、0.776μg增加到增殖組的1.3691μg,有明顯的摻入增加；高濃度血清培養(yǎng)細(xì)胞48h后觀察到細(xì)胞開始進(jìn)入對(duì)數(shù)期,增殖生長(zhǎng)提前,具有增殖特性；細(xì)胞G0／G1期的細(xì)胞數(shù)減少,進(jìn)入S期的細(xì)胞數(shù)則明顯增多,增殖指數(shù)達(dá)77.79％;增殖細(xì)胞的平面遷移能力明顯提高,增殖細(xì)胞組的遷移數(shù)目為未增殖組的11.428倍,遷移距離為未增殖組的4.140倍；增殖組的細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)蛋白粘附結(jié)合能力有所增加,與骨橋蛋白的粘附數(shù)目是未增殖組的2.042倍,與層

5、粘連蛋白的粘附數(shù)目是未增殖組的1.742倍。因此,高濃度血清培養(yǎng)細(xì)胞影響細(xì)胞行為,引起VSMC的增殖、遷移與粘附,可用于體外增殖模型的研究。
　　 研究了各功效成分對(duì)紅細(xì)胞溶血、血清氧化、組織脂質(zhì)過氧化及·OH、·O2-和DPPH自由基的清除和對(duì)Fe3+的還原能力。功效成分根據(jù)其分子結(jié)構(gòu)的不同,其抗氧化效果側(cè)重不同。當(dāng)歸的主要功效成分阿魏酸主要通過清除自由基及還原Fe3+表現(xiàn)其抗氧化能力。對(duì)·O2-和DPPH自由基清除的IC50

6、分別為119.33及4.57μg／mL；對(duì)Fe3+的相對(duì)還原能力是Vit C的2.118倍。女貞的功效成分齊墩果酸抑制紅細(xì)胞溶血和肝勻漿脂質(zhì)過氧化,IC50分別為277.72和213,.52μg／mL,對(duì)Fe3+還原能力是Vit C的2倍。山藥功效成分1,8-二羥基蒽醌抑制血清自氧化、清除·O2-、·OH自由基,其IC50分別為359.32、65.91和48.57μg／mL。決明子功效成分薯蕷皂苷元抑制紅細(xì)胞溶血和血清自氧化,其IC50

7、分別為197.50μg／mL和95.37μg／mL；清除·OH和DPPH自由基,IC50分別為19.17μg／mL和1.84μg／mL。表明各功效成分可能通過對(duì)自由基清除、金屬離子還原、蛋白結(jié)合等方式抑制脂質(zhì)過氧化、紅細(xì)胞溶血,降低血清自氧化,從而對(duì)血液氧化應(yīng)激產(chǎn)生保護(hù)作用。
　　 從細(xì)胞形態(tài)、蛋白和DNA合成、細(xì)胞周期等方面研究了天然產(chǎn)物功效成分對(duì)VSMC增殖活性的抑制作用。功效成分影響細(xì)胞形態(tài),延緩細(xì)胞生長(zhǎng),但均不具有明顯細(xì)

8、胞毒性。在終濃度為100μmol／L時(shí),阿魏酸、齊墩果酸、1,8-二羥基蒽醌和薯蕷皂苷元抑制細(xì)胞相對(duì)活力,抑制率分別56.101、72.317、57.036和54.154％；抑制VSMCs蛋白合成分別達(dá)57.519、75.924、60.559和54.396％；降低DNA合成,BrdU摻入量由對(duì)照組的1.613μg下降為1.204、1.210、1.445和1.2.75μg；阻抑細(xì)胞周期,使PI指數(shù)由對(duì)照組的77.79％下降為65.26、6

9、0.28、71.36和59.85％,結(jié)果表明各功效成分對(duì)血清誘導(dǎo)的平滑肌細(xì)胞增殖有較好的抑制作用。此外,功效成分有效抑制血清刺激的VSMCs遷移和與細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的粘附。在濃度為100μmol／L時(shí),阿魏酸、齊墩果酸組、1,8-二羥基蒽醌和薯蕷皂苷元對(duì)遷移細(xì)胞數(shù)目的抑制率分別達(dá)73.78、48.59、70.81和58.96％,同時(shí)對(duì)遷移距離的抑制率分別為67.69、70.90、59.36和62.56％,有效抑制血清刺激增殖的細(xì)胞遷移；對(duì)

10、與骨橋蛋白粘附細(xì)胞數(shù)的抑制率分別達(dá)29.231、48.308、53.231和56.923％；同時(shí)對(duì)與層粘連蛋白粘附細(xì)胞抑制率分別為51.104、54.2598、64.038和67.192％。結(jié)果表明功效成分有效抑制VSMCs的增殖、遷移和粘附等行為,提示具有抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。
　　 本實(shí)驗(yàn)研究了修飾的大豆苷元衍生物在平滑肌細(xì)胞體內(nèi)的吸收代謝。大豆苷元衍生物DD1和DD2更易被血管平滑肌細(xì)胞吸收,48h時(shí)的吸收利用率分別達(dá)到71

11、.672％和61.435％,均優(yōu)于大豆苷元54.584％的吸收率；衍生物化合物在細(xì)胞內(nèi)被持續(xù)代謝為原藥,發(fā)揮其功效。對(duì)VSMC作用表明,大豆苷元衍生物濃度依賴性抑制VSMC增殖、遷移和粘附,沒有明顯細(xì)胞毒性。在100μmol／L時(shí)DD1、DD2及daidzein對(duì)VSMC增殖的抑制率分別可達(dá)84.47、68.53和66.35％；對(duì)遷移細(xì)胞數(shù)目的抑制率分別達(dá)58.52、54.07和49.63％；同時(shí)對(duì)遷移距離的抑制率分別為81.17、71

12、.43和63.64％；對(duì)與骨橋蛋白粘附的細(xì)胞數(shù)目抑制率分別達(dá)48.308、47.077和46.769％；對(duì)與層粘連蛋白黏附的細(xì)胞抑制率分別達(dá)67.823、64.038和57.413％。此外,大豆苷元衍生物影響血清刺激的增殖HUVSMC細(xì)胞周期,與增殖對(duì)照組相比,DD1、DD2和daidzein使G0／G1期細(xì)胞增多,S期細(xì)胞減少,增殖指數(shù)分別為54.31％、56.39％和70.91％,均低于增殖對(duì)照組的77.79％。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示大豆苷元

13、及其衍生物可能通過對(duì)VSMCs的增殖遷移的抑制具有抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。
　　 對(duì)天然產(chǎn)物功效成分對(duì)VSMCs的NOS／NO調(diào)節(jié)作用進(jìn)行了研究。結(jié)果表明,功效成分上調(diào)NOS相對(duì)活力,促進(jìn)體系中NO的產(chǎn)生。在100μmol／L時(shí),阿魏酸、齊墩果酸、1,8-二羥基蒽醌、薯蕷皂苷元組細(xì)胞中NO含量分別為20.749、31.797、18.624和16.250μmol／gprot,均高于對(duì)照組10.161μmol／gprot；NOS相對(duì)活力

14、分別為1.008、1.061、0.900和0.798U／mgprot,均高于對(duì)照組0.668U／mgprot。NOS酶活力作用順序與各組細(xì)胞中NO產(chǎn)生結(jié)果一致,均為:齊墩果酸>阿魏酸>1,8-二羥基蒽醌>薯蕷皂苷元,提示藥物對(duì)細(xì)胞NOS活力造成調(diào)節(jié),從而調(diào)節(jié)系統(tǒng)中NO的產(chǎn)生。
　　 為了觀察血清培養(yǎng)對(duì)血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響及功效成分對(duì)其的調(diào)控,實(shí)驗(yàn)采用real time PCR.檢測(cè)了增殖細(xì)胞中周期相關(guān)因子mRNA的表達(dá)情況,

15、初步探討功效成分對(duì)血管平滑肌細(xì)胞增殖的調(diào)控。結(jié)果發(fā)現(xiàn),血清培養(yǎng)細(xì)胞引起細(xì)胞增殖,細(xì)胞中CDK2 mRNA表達(dá)增強(qiáng),p27kip1 mRNA表達(dá)受抑。和血清刺激組相比,功效成分組細(xì)胞CDK2 mRNA的表達(dá)受抑,p27kiP1mRNA的表達(dá)增強(qiáng)。表明:功效成分可能通過下調(diào)周期蛋白依賴性激酶,上調(diào)激酶抑制蛋白的表達(dá)來進(jìn)行調(diào)控周期進(jìn)程,從而影響細(xì)胞增殖。提示,功效成分對(duì)可能增殖細(xì)胞周期相關(guān)因子的催化活性部分進(jìn)行干預(yù),而不造成調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)抑制