金屬蛋白酶組織抑制劑對(duì)兔動(dòng)脈粥樣硬化血管平滑肌細(xì)胞及巨噬細(xì)胞的功能影響研究.pdf

1、心腦血管疾病現(xiàn)已成為人類(lèi)生命健康的頭號(hào)殺手，研究發(fā)現(xiàn)動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是動(dòng)脈瘤、心肌梗塞等心腦血管疾病最主要的病理基礎(chǔ)。因此，AS的早期預(yù)防和治療對(duì)于提高人們的生活質(zhì)量有著重要的意義。
　　基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinases，MMPs)是一類(lèi)依賴(lài)于鋅、鈣離子的內(nèi)肽酶，其在生理?xiàng)l件下幾乎能降解所有細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)成分。在血

2、管內(nèi)皮損傷及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、血管重構(gòu)、粥樣斑塊形成及發(fā)展過(guò)程中，均起著重要作用。金屬蛋白酶組織抑制劑(tissue inhibitor of metallo-proteinases，TIMPs)是MMPs的天然拮抗劑，它通過(guò)對(duì)MMPs的抑制在正常ECM改建和各種病理過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。大量研究證明動(dòng)脈粥樣硬化及動(dòng)脈瘤病變局部MMPs和TIMPs比例失衡，MMPs水平增高及TIMPs水平降低。
　　基于以上認(rèn)識(shí)，我們?cè)O(shè)想以覆膜血管內(nèi)

3、支架為載體，實(shí)現(xiàn)主動(dòng)脈壁局部功能基因轉(zhuǎn)染，提高主動(dòng)脈壁局部TIMP水平，抑制MMPs的蛋白水解作用，從而改善血管結(jié)構(gòu)。在主動(dòng)脈壁局部功能基因轉(zhuǎn)染前，我們先評(píng)價(jià)TIMPs對(duì)參與動(dòng)脈粥樣硬化及動(dòng)脈瘤病變關(guān)系最密切的血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)及巨噬細(xì)胞的功能影響，以便為進(jìn)一步選擇目的治療基因?qū)崿F(xiàn)主動(dòng)脈局部基因轉(zhuǎn)染并促進(jìn)主動(dòng)脈病變修復(fù)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　本研究分為三部分:
　　

4、第一部分:胰彈性蛋白酶浸潤(rùn)加高脂飲食法建立兔腹主動(dòng)脈粥樣硬化模型。
　　目的:評(píng)價(jià)在高脂飼料喂養(yǎng)基礎(chǔ)上采用胰彈性蛋白酶(pancreatic elastase，PE)浸潤(rùn)法制備兔主動(dòng)脈粥樣硬化模型的可行性。
　　方法:分別采用高脂飼料喂養(yǎng)+PE浸潤(rùn)法及高脂飼料喂養(yǎng)+球囊損傷法制備兔AS模型，設(shè)立正常飲食組作為對(duì)照。通過(guò)生化指標(biāo)、影像學(xué)檢查、病理形態(tài)學(xué)及免疫組織化學(xué)檢測(cè)評(píng)價(jià)高脂飼料喂養(yǎng)+PE浸潤(rùn)法造模結(jié)果，并與正常飲食組及高脂

5、飼料喂養(yǎng)+球囊損傷法造模結(jié)果相比較。
　　結(jié)果:血管造影檢查，PE浸潤(rùn)局部管腔較正常血管略擴(kuò)張，形態(tài)不規(guī)整，有進(jìn)一步縮小趨勢(shì)。病理形態(tài)學(xué)檢測(cè)，PE浸潤(rùn)組動(dòng)脈內(nèi)膜增厚，伴有脂質(zhì)沉積，可見(jiàn)斑塊形成。半定量分析PE組及球囊損傷組彈性蛋白成分明顯低于正常對(duì)照組，兩實(shí)驗(yàn)組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。免疫組織化學(xué)檢測(cè)，PE浸潤(rùn)組及球囊損傷組MMP-9，MMP-2及巨噬細(xì)胞免疫染色與對(duì)照組相比均顯示出較高水平的蛋白表達(dá)，對(duì)照組沒(méi)有MMP-2、MMP-9

6、及巨噬細(xì)胞表達(dá)，兩實(shí)驗(yàn)組間沒(méi)有明顯差異。
　　結(jié)論:高脂飼料喂養(yǎng)加PE浸潤(rùn)法處理后，局部血管病理形態(tài)學(xué)及免疫組織化學(xué)結(jié)果都與AS改變相符合，證實(shí)了PE浸潤(rùn)動(dòng)脈外周后損傷內(nèi)膜的有效性及制備AS模型的可行性。
　　第二部分:TIMPs對(duì)兔動(dòng)脈粥樣硬化血管壁平滑肌細(xì)胞遷移、凋亡、增殖的功能影響及機(jī)制探討。
　　目的:評(píng)價(jià)不同濃度TIMP-1，2，3對(duì)兔動(dòng)脈粥樣硬化血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle

7、cell，VSMC)體外遷移、凋亡、增殖功能的影響及機(jī)制探討。
　　方法:采用transwell小室法進(jìn)行VSMC的遷移實(shí)驗(yàn)，通過(guò)比較遷移細(xì)胞數(shù)量評(píng)價(jià)TIMPs對(duì)遷移能力的影響。通過(guò)BrdU熒光染色，評(píng)價(jià)TIMPs對(duì)VSMC增殖能力的影響。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)VSMC凋亡。
　　結(jié)果:遷移實(shí)驗(yàn):不同濃度TIMP-1，2，3組鏡下計(jì)數(shù)遷移細(xì)胞數(shù)與對(duì)照組相比均有減少。增殖實(shí)驗(yàn):3ng/ml濃度TIMP-1，2，3鏡下計(jì)數(shù)核染細(xì)胞數(shù)

8、與對(duì)照組相比無(wú)差別，其余各濃度實(shí)驗(yàn)組核染細(xì)胞數(shù)與對(duì)照組相比均有減少。凋亡實(shí)驗(yàn):各濃度TIMP-1組VSMC凋亡率與對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，10ng/ml-100ng/ml濃度TIMP-2，3組VSMC早期凋亡率與對(duì)照組相比有降低。
　　結(jié)論:濃度3ng/ml-100ng/ml TIMP-1，2，3對(duì)VSMC體外遷移有抑制作用;濃度10ng/ml-100ng/ml TIMP-1，2，3對(duì)VSMC體外增殖有抑制作用，濃度3ng/ml

9、TIMP-1，2，3對(duì)VSMC體外增殖無(wú)作用;TIMP-1對(duì)VSMC早期凋亡無(wú)影響，10ng/ml-100ng/ml濃度TIMP-2，3對(duì)VSMC早期凋亡有抑制作用。
　　第三部分:TIMPs對(duì)兔腹腔巨噬細(xì)胞體外遷移、凋亡、MMP-9合成功能的影響及機(jī)制研究。
　　目的:評(píng)價(jià)不同濃度TIMP-1，2，3對(duì)兔腹腔巨噬細(xì)胞體外遷移、凋亡及MMP-9合成功能的影響。
　　方法:采用transwell小室法進(jìn)行巨噬細(xì)胞的遷移實(shí)

10、驗(yàn)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)VSMC凋亡，Western blotting法檢測(cè)巨噬細(xì)胞合成MMP-9含量變化。
　　結(jié)果:濃度10ng/ml-100ng/ml TIMP-2，3組遷移細(xì)胞數(shù)與對(duì)照組相比有明顯減少，各濃度TIMP-1實(shí)驗(yàn)組及濃度3ng/ml TIMP-2，3實(shí)驗(yàn)組遷移細(xì)胞數(shù)與對(duì)照組相比沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;濃度10ng/ml-100ng/ml TIMP-2，3組巨噬細(xì)胞早期凋亡率與對(duì)照組相比有降低，各濃度TIMP-1實(shí)驗(yàn)組巨噬細(xì)胞

11、凋亡率與對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;濃度10 ng/ml-100ng/ml TIMP-2，3組MMP-9條帶灰度值均低于對(duì)照組。
　　結(jié)論:濃度10ng/ml-100ng/ml TIMP-2，3對(duì)兔腹腔巨噬細(xì)胞體外遷移有抑制作用。TIMP-1及低濃度（3ng/ml）TIMP-2，3對(duì)巨噬細(xì)胞遷移無(wú)影響;濃度10ng/ml-100ng/ml TIMP-2，3對(duì)兔腹腔巨噬細(xì)胞凋亡有抑制作用，TIMP-1對(duì)巨噬細(xì)胞凋亡無(wú)影響;濃度10ng/