DQ方抗ApoE基因敲除小鼠動脈粥樣硬化的研究.pdf

1、動脈粥樣硬化斑塊破裂或潰瘍繼發(fā)管腔內(nèi)血栓形成，是突發(fā)性心腦血管疾病的主要病理基礎。近年的研究顯示，炎癥反應是導致斑塊不穩(wěn)定的主要因素。本論文以中醫(yī)“痰瘀毒”理論為指導對動脈粥樣硬化疾病進行探析，系統(tǒng)闡述“痰瘀毒”在動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中的作用;并在該理論指導下，制定DQ方，以化痰、祛瘀、解毒為治則對ApoE基因敲除小鼠動脈粥樣硬化模型進行干預治療，評估其療效，以及探討抗動脈粥樣硬化的機制。
　　目的:1.評估DQ方抗動脈粥樣硬化作

2、用及機制;2.證明“痰瘀毒”在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中有重要作用。
　　方法:選擇8周齡雄性ApoE基因敲除小鼠60只作為實驗對象，普通飼料適應性喂養(yǎng)2周后，給予含脂肪21％(wt/wt)、膽固醇0.15％(wt/wt)的“西方類型膳食”的高脂飼料喂養(yǎng)。高脂飲食4周后隨機處死5只，無菌解剖取出小鼠心臟、主動脈根部及整條主動脈至髂動脈分叉處，4％多聚甲醛固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋切片，切片厚5um，蘇木素-尹紅染色，光鏡下確定已形成動

3、脈硬化病變形成，繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)2周。確定動脈粥樣硬化病變形成后隨機將小鼠平均分為4組;模型組14只、DQ方組（小劑量）14只、DQ方組（中劑量）14只、DQ方組（大劑量）14只。同時設立同品系C57BL/6J小鼠15只作為空白對照組，始終給予做普通飼養(yǎng)，正常飲食。實驗從開始到灌胃結(jié)束，每周測一次體重并記錄。按照成人與小鼠給藥劑量換算公式計算小鼠的給藥量。DQ方按照小鼠體重灌胃給藥。各組每日量分兩次給藥，間隔時間大于6小時，連續(xù)灌胃30

4、天。每周根據(jù)體重變化調(diào)整藥量。30天后停止灌胃，藥物干預結(jié)束。取材前24h禁食不禁水，ApoE基因敲除雄性小鼠稱重后計算麻醉藥物劑量經(jīng)4％水合氯醛(0.1ml/10g)腹腔麻醉，腹主動脈取血，處死動物，取出心臟和主動脈，予以固定。參照Suzuki等確立的方法，每只小鼠的主動脈根部留取4個相同界面切片，相鄰切片分別行HE染色以及免疫組織化學染色。鏡下觀察以下內(nèi)容:1.主動脈根部斑塊形態(tài)結(jié)構(gòu)及其內(nèi)部成分，重點觀察斑塊大小、斑塊內(nèi)脂質(zhì)核大小、

5、纖維帽情況，IPP6.0圖像分析軟件測量斑塊面積、斑塊內(nèi)細胞外脂質(zhì)含量，對病理形態(tài)變化予以分析。2.酶聯(lián)夾心法測血清TC、ox-LDL、Visfatin水平;3.免疫組化方法測主動脈根部斑塊內(nèi)NF-κ Bp65、CD68表達情況。
　　結(jié)果:1.ApoE基因缺陷小鼠高脂飼料喂養(yǎng)4周，在主動脈根部可形成明顯的斑塊:斑塊脂核大且纖維帽薄、炎癥細胞浸潤。2.灌胃前、造模期間，模型組、治療組體重較空白對照組明顯升高(P＜0.05);灌胃前

6、-后治療組體重下降比模型組明顯。模型組小鼠毛色普遍缺乏光澤度，活動較差，精神萎靡，排泄尚正常。DQ方高劑量組、DQ方中劑量組、DQ方低劑量組小鼠的活動度、皮毛光澤、精神狀態(tài)較模型組有所改善。3.模型組與治療組血清TC、ox-LD均明顯升高(P＜0.05);治療組TC、ox-LD較模型組下降(P＜0.05);DQ方高、中、低劑量組組間無明顯差異(P＞0.05)。4.模型組小鼠血清Visfatin含量較空白對照組明顯升高(P＜0.01);治

7、療組血清Visfatin含量低于模型組(P＜0.05)。5.HE染色光鏡下觀察各組切片:空白組小鼠主動脈根部無斑塊形成，內(nèi)膜光滑。與空白組比較，模型組小鼠主動脈根部形成成熟的動脈粥樣硬化斑塊，細胞外脂質(zhì)核心形成，顯示為針尖、柳葉、結(jié)晶狀的白色空隙或融合的白色團塊。模型組、治療組組間斑塊面積大小無顯著差異(P＞0.05)。與模型組比較，DQ方中劑量組與DQ方低劑量組斑塊內(nèi)的細胞外脂質(zhì)面積減少(P＜0.05);DQ方高劑量組與模型組比較，細

8、胞外脂質(zhì)面積差異(P＞0.05)。6.與模型組比較，治療組NF-κ Bp65表達下降，有統(tǒng)計學差異(P＜0.05);各治療組組間NF-κ Bp65陽性表達無顯著差異(P＞0.05)。7.空白組小鼠主動脈根部無CD68陽性表達。與正常組比較，模型組小鼠斑塊局部CD68表達顯示升高。與模型組比較，DQ方高劑量組、DQ方中劑量組與DQ方低劑量組表達明顯減低，有統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。DQ方高劑量組、DQ方中劑量組與DQ方低劑量組組間CD6