部分結(jié)扎頸總動(dòng)脈誘導(dǎo)ApoE基因敲除大鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型及mTOR的相關(guān)性分析.pdf

1、目的:
　　目前，ApoE-/-小鼠是已成功建立的較好的研究動(dòng)脈粥樣硬化的模型動(dòng)物，然而其牽涉各動(dòng)脈分支的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊分布以及斑塊內(nèi)組成成分與動(dòng)脈粥樣硬化病人有很大程度的不同。并且，考慮到其較小的體型，并不適合血管內(nèi)成形術(shù)、試驗(yàn)新型藥物支架或者新型醫(yī)療裝置。雖然類如小型豬、犬類等大型動(dòng)物當(dāng)前也應(yīng)用于血管移植方面的研究，但其價(jià)格也是不菲的。
　　大鼠在研究心血管疾病方面，特別是高血壓及腦卒中，是優(yōu)秀而且適合的模型動(dòng)物。相對(duì)

2、于小鼠，大鼠的生理狀況也更容易檢測(cè)，也更類似于相應(yīng)的人類情況，其大小也更適合血管內(nèi)介入的操作。但目前為止，并沒(méi)有適合動(dòng)脈粥樣硬化的大鼠模型。
　　雖然前期不同的研究團(tuán)隊(duì)都嘗試著用不同的誘導(dǎo)方法，去建立動(dòng)脈粥樣硬化模型，但這些結(jié)果仍然是不確定的。飲食誘導(dǎo)的高膽固醇血癥并不能誘發(fā)大鼠的動(dòng)脈粥樣硬化，因此普遍認(rèn)為大鼠具有對(duì)高脂的抵抗性，另一個(gè)可能的原因則為高脂誘導(dǎo)的高膽固醇血癥，其血膽固醇水平仍不足以引起動(dòng)脈粥樣硬化。
　　因此，

3、嘗試通過(guò)轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶（transcription activator-likeeffector nucleases，TALENs）技術(shù)，構(gòu)建ApoE基因敲除大鼠，給予高膽固醇飲食，誘發(fā)其極高水平的高膽固醇血癥，再采用部分結(jié)扎頸總動(dòng)脈的手術(shù)方式造成紊亂的血流剪切力，導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷，從而建立大鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型并進(jìn)行評(píng)價(jià)。
　　哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是調(diào)控平滑肌細(xì)胞增殖的關(guān)鍵分子，而近年來(lái)平滑肌細(xì)胞增殖被認(rèn)

4、為在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和演變中均有重要作用，前期研究也發(fā)現(xiàn)mTOR的表達(dá)與小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的負(fù)荷具有相關(guān)性。因此，在本研究中擬進(jìn)一步探討冠心病患者外周血淋巴細(xì)胞mTOR的表達(dá)水平與冠脈狹窄程度的相關(guān)性。
　　方法:
　　研究分為兩部分
　　第一部分 ApoE-/-大鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型建立及評(píng)價(jià)
　　1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及ApoE-/-大鼠的構(gòu)建
　　雄性SD大鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照組，采用TALENs技術(shù)以SD大鼠為遺

5、傳背景構(gòu)建ApoE敲除大鼠，所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均SPF環(huán)境培養(yǎng)，自由取食及飲水。
　　2.高膽固醇飲食飼養(yǎng)
　　將6-8周齡大小雄性SD野生型及ApoE-/-大鼠隨機(jī)分為普通飲食及高膽固醇飲食四組，高膽固醇飲食成分為67.8％基礎(chǔ)飼料，10％豬油，1.5％膽固醇，0.5％膽酸鈉，15％蛋黃粉，0.2％甲硫氧嘧啶，以及1.5％蔗糖。
　　3.ApoE-/大鼠生理情況測(cè)量
　　經(jīng)過(guò)普通及高膽固醇飲食飼養(yǎng)12周后，測(cè)量每組體

6、重、隨機(jī)血糖、心率、動(dòng)脈血壓。
　　4.血脂及血清炎性因子的測(cè)量
　　檢測(cè)其血清TG水平、TC水平、LDL-c水平、HDL-c水平，ELISA檢測(cè)其腫瘤壞死因子α、白介素1β、白介素6、白介素10水平。
　　5.主動(dòng)脈大體油紅染色
　　6.部分結(jié)扎左側(cè)頸總動(dòng)脈
　　將6-8周齡大小雄性WT及ApoE-/-大鼠經(jīng)過(guò)高膽固醇飲食處理10周后，部分結(jié)扎左側(cè)頸總動(dòng)脈，右側(cè)頸總動(dòng)脈作為對(duì)照，繼續(xù)高膽固醇飲食兩周后取材

7、。
　　7.組織病理分析
　　主動(dòng)脈根部及雙側(cè)頸總動(dòng)脈進(jìn)行油紅O染色、HE染色、MASSON染色，雙側(cè)頸總動(dòng)脈進(jìn)行免疫熒光染色（CD31、CD68、α-SMA），以及TUNEL染色。
　　8.實(shí)時(shí)熒光定量PCR
　　1)檢測(cè)主動(dòng)脈MCP-1、VCAM-1的mRNA表達(dá)情況
　　2)檢測(cè)頸總動(dòng)脈MCP-1、VCAM-1、mTOR的mRNA表達(dá)情況
　　第二部分 外周血淋巴細(xì)胞mTOR mRNA水平與冠心

8、病患者冠脈病變程度的相關(guān)性分析
　　1.收集臨床冠脈造影陽(yáng)性及陰性結(jié)果患者病例資料
　　2.檢測(cè)外周血淋巴細(xì)胞mTOR mRNA表達(dá)情況
　　3.進(jìn)行相關(guān)臨床指標(biāo)及mTOR與冠狀動(dòng)脈病變程度的相關(guān)性分析
　　結(jié)果:
　　1.成功構(gòu)建ApoE-/-大鼠
　　運(yùn)用TALENs技術(shù)成功構(gòu)建以SD大鼠為遺產(chǎn)背景的ApoE-/-大鼠，基因組DNA測(cè)序結(jié)果顯示其相對(duì)于野生型大鼠，于ApoE基因核心編碼區(qū)缺失14個(gè)

9、堿基對(duì)。
　　2.ApoE-/-大鼠生理情況
　　普通飲食下ApoE-/-大鼠和野生型大鼠體重?zé)o明顯差異，但高膽固醇飲食喂養(yǎng)12周后，兩種基因型大鼠體重均出現(xiàn)顯著的降低(P＜0.05)，而且高膽固醇飲食均造成ApoE-/-大鼠與野生型大鼠隨機(jī)血糖輕微的上升(P＜0.05)。ApoE-/-大鼠相比野生型大鼠心率血壓并無(wú)明顯變化，說(shuō)明ApoE基因缺陷并未對(duì)心率血壓造成影響，但是高膽固醇飲食卻導(dǎo)致了ApoE-/-大鼠和野生型大鼠心

10、率血壓不同程度的下降(P＜0.05)。
　　同既往的研究類似，高膽固醇飲食僅僅造成了野生型大鼠TG及LDL-c輕微幅度的升高(P＜0.01)，但卻促成了ApoE-/-大鼠極其顯著的上升(P＜0.01)，形成了典型的血脂紊亂。
　　3.ApoE-/-大鼠對(duì)高膽固醇血癥的抵抗性
　　四組大鼠主動(dòng)脈大體油紅染色均呈陰性結(jié)果，同時(shí)，主動(dòng)脈根部H&E染色也未發(fā)現(xiàn)明顯的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成。
　　進(jìn)一步探究原因，四組大鼠EL

11、ISA檢測(cè)血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平并沒(méi)有明顯的較大差異，實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示高膽固醇飲食喂養(yǎng)的ApoE-/-大鼠主動(dòng)脈MCP-1、VCAM-1也僅僅是呈數(shù)倍的升高(P＜0.05)。
　　4.部分結(jié)扎左側(cè)頸總動(dòng)脈誘導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化
　　高膽固醇飲食背景下，部分結(jié)扎左側(cè)頸總動(dòng)脈兩周后的ApoE-/-大鼠及野生型大鼠H&E染色均顯示出大小面積相似的斑塊形成，MASSON染色結(jié)果均提示有少量纖維素沉積，但ORO染

12、色結(jié)果顯示ApoE-/-大鼠斑塊內(nèi)陽(yáng)性，而野生型大鼠則為陰性。
　　免疫熒光染色結(jié)果顯示ApoE-/-大鼠斑塊內(nèi)富集大量的CD68陽(yáng)性巨噬細(xì)胞，相比之下，野生型大鼠斑塊內(nèi)則顯示富集大量平滑肌細(xì)胞而無(wú)CD68陽(yáng)性巨噬細(xì)胞，另外，ApoE-/-大鼠斑塊內(nèi)有CD31陽(yáng)性的新生血管出現(xiàn)，而野生型大鼠則未發(fā)現(xiàn)明顯CD31陽(yáng)性結(jié)果。
　　實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，兩種基因型大鼠與正常右側(cè)頸總動(dòng)脈相比，結(jié)扎側(cè)的頸總動(dòng)脈MCP-1、VCA

13、M-1、mTOR均有顯著升高(P＜0.01)。
　　5.兩組患者臨床指標(biāo)的比較
　　冠狀動(dòng)脈病變組的年齡、BMI、TG、TC、LDL-c、Gensini積分與冠狀動(dòng)脈正常組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而其他因素如性別、民族、心率、血壓、空腹血糖、FFA、ALT、AST、Scr、BUN、UA、HDL-c、ApoA、ApoB、LPA則差異無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　6.各臨床指標(biāo)及mTOR mRNA水平及與冠脈狹窄程

14、度的相關(guān)分析
　　全部患者TG、TC、年齡及外周血淋巴細(xì)胞mTOR表達(dá)水平均與冠狀動(dòng)脈病變的Gensini積分成正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r分別為0.254、0.236、0.207、0.343，P值均＜0.01，而LDL、BMI則與冠脈狹窄程度無(wú)明顯相關(guān)性。
　　結(jié)論:
　　ApoE-/-大鼠可成為高膽固醇血癥新型模型，通過(guò)部分結(jié)扎左側(cè)頸總動(dòng)脈可建立動(dòng)脈粥樣硬化模型，其mTOR表達(dá)水平顯著升高，臨床回歸性研究可驗(yàn)證患者外周血淋巴