基于ApoE基因敲除小鼠的動脈硬化研究.pdf

1、目的:動脈粥樣硬化發(fā)生機(jī)制復(fù)雜。目前AS的主要治療方法是手術(shù)治療和他汀藥物治療，手術(shù)可緩解組織缺血但無法改變AS病程，他汀藥物可降低血清LDL-C水平但對人體存在一些副作用。本課題組擬采用基因或細(xì)胞干預(yù)的方式對動脈粥樣硬化模型小鼠進(jìn)行治療并檢測評估其效果，致力于尋找更好的治療方案。
　　方法與結(jié)果:高脂飼料喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠四個(gè)月，飼養(yǎng)前后分別稱量小鼠體重、檢測血脂水平，處死部分小鼠后取腹主動脈和肝臟，HE染色觀察組織結(jié)構(gòu)改變

2、。結(jié)果顯示:高脂飼養(yǎng)組小鼠體重減輕;血脂明顯上升;腹主動脈內(nèi)膜增厚，有斑塊形成;肝臟結(jié)構(gòu)紊亂，大部分肝細(xì)胞腫脹呈氣球樣變，并可見肝細(xì)胞空泡變性。結(jié)果表明動脈粥樣硬化小鼠模型建立成功。采用PEI方法，三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，分別包裝了rAAV-PON1、rAAV-PON1-ApoA1兩種病毒并用超速離心層析法對其純化，real-time PCR法檢測其滴度，轉(zhuǎn)染MSCs檢測其活性。結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)獲得了較高純度、較高滴度和較好活性的病

3、毒，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。采用全骨髓貼壁法體外培養(yǎng)C57BL/6小鼠EPCs。顯微鏡下觀察培養(yǎng)的EPCs細(xì)胞形態(tài)成鵝卵石狀;免疫組化檢測vWF和flk-1表達(dá)為陽性;免疫熒光鑒定結(jié)果表明所培養(yǎng)細(xì)胞具有吞噬Dil-ac-LDL和攝取FITC-UEA-1的能力，可用于對動脈粥樣硬化模型小鼠進(jìn)行細(xì)胞治療。將rAAV-PON1、rAAV-PON1-ApoA1、EPCs分別經(jīng)尾靜脈注射到模型小鼠體內(nèi)。治療四個(gè)月后，檢測小鼠體重、血脂水平，real-ti

4、me PCR法檢測ApoA1、PON1、eNOS、CRP基因表達(dá)，Western-blot法檢測人PON1蛋白在小鼠體內(nèi)的表達(dá)，HE染色觀察腹主動脈和肝臟組織結(jié)構(gòu)，免疫組織化學(xué)染色法測定α-actin和MAC-3表達(dá)。結(jié)果表明單、雙基因和EPCs對AS都起一定干預(yù)作用，其中單基因效果優(yōu)于其它組，干預(yù)效果最為明顯。
　　結(jié)論:本課題組建立了動脈粥樣硬化小鼠模型，體外分離并培養(yǎng)了與模型鼠同品系的C57BL/6小鼠的EPCs，包裝了重組