CMV-Cre-EGFP轉(zhuǎn)基因小鼠的建立.pdf

1、目的：制備轉(zhuǎn)CMV-Cre-EGFP基因小鼠并檢測其表達的Cre酶的重組活性。 方法：用Nsi I、AflII雙酶切質(zhì)粒pCMV-Cre-EGFP后，純化回收3.3kb大小的DNA片段，稀釋成2.9ng/ul的注射用DNA溶液，將其用顯微注射的方法直接注入超排得到的B6D2F2受精卵的原核內(nèi)，體外培養(yǎng)至2-細胞后，一部分胚胎繼續(xù)培養(yǎng)，體外觀察轉(zhuǎn)基因的表達情況，其余的移植到假孕ICR母鼠的輸卵管內(nèi)，待其懷孕產(chǎn)仔后，短波光下觀察小鼠

2、是否發(fā)出綠色熒光，同時抽提鼠尾DNA，用PCR法檢測仔鼠是否為轉(zhuǎn)基因陽性動物，將轉(zhuǎn)基因陽性子代與基因組上整合有LoxP位點和LacZ表達框的ROSA26報告小鼠雜交，通過LacZ染色檢測Cre重組酶在體內(nèi)介導(dǎo)重組的功能。通過遺傳育種的方法獲得純合子小鼠并建系。 結(jié)果：共注射了2391個受精卵，繼續(xù)培養(yǎng)，有1500個胚胎發(fā)育至2-細胞，存活率為62.74％，將1390個存活的胚胎移植到73只假孕ICR母鼠的輸卵管內(nèi)，共有15只移植