5-脂氧化酶轉(zhuǎn)基因小鼠模型的建立.pdf

1、目的：
　　 動脈粥樣硬化(Atherosclerosis,AS)是一種嚴(yán)重危害人類健康的疾病,是導(dǎo)致心肌梗死、腦卒中等疾病的危險(xiǎn)因素。目前國內(nèi)外研究熱點(diǎn)多集中于從基因誘導(dǎo)方面研究AS形成的病理機(jī)制,近年來證據(jù)表明5-脂氧化酶(5-lipoxygenase,5-LO)途徑在動脈粥樣硬化的形成和發(fā)展以及動脈粥樣硬化斑塊的不穩(wěn)定性中有非常重要的作用。目前已利用5-LO敲除小鼠實(shí)驗(yàn)證明5-LO基因與AS發(fā)病密切相關(guān),但5-LO缺陷小鼠

2、并不能模擬AS病人在5-LO基因高表達(dá)狀態(tài)下導(dǎo)致的一系列炎癥反應(yīng)過程,而5-LO過表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠模型將克服基因敲除小鼠的不足,可能成為研究AS炎癥機(jī)制的理想模型。本實(shí)驗(yàn)利用融合表達(dá)載體pEGFP-5LO穩(wěn)定轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞并初步研究其表達(dá)情況,通過顯微注射法,建立5-LO過表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠模型,為探索5-LO基因?qū)S的防治作用奠定基礎(chǔ)。
　　 方法
　　 提取人外周血總RNA作為模版,根據(jù)GenBank中5-LO

3、基因序列設(shè)計(jì)一對引物,通過RT-PCR方法擴(kuò)增出2000bp的5-LO基因全長,克隆到pUCm-T載體,通過測序證實(shí)序列的正確性。用EcoR Ⅰ酶切載體pEGFP-C2和pUCm-5-LO連接產(chǎn)物,回收、連接、轉(zhuǎn)化、鑒定,從而成功構(gòu)建了pEGFP-5-LO表達(dá)質(zhì)粒。將pEGFP-5-LO表達(dá)質(zhì)粒體外穩(wěn)定轉(zhuǎn)染小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞,以轉(zhuǎn)染空載體pEGFP-C2的RAW264.7細(xì)胞作對照,應(yīng)用RT-PCR和Western-bl

4、ot方法分析5-LO在RAW264.7細(xì)胞中的表達(dá)情況。pEGFP-5-L0質(zhì)粒經(jīng)StuⅠ單酶切,QIAquick Gel extraction Kit試劑盒純化回收約6.Skp目的片斷,應(yīng)用顯微注射法將外源目的基因?qū)胧芫言酥?并將注射后的受精卵移植到同期受孕的假孕母鼠輸卵管中,提取新生小鼠鼠尾基因組DNA,進(jìn)行PCR和Southern blot方法鑒定,并應(yīng)用RT-PCR、Western-blot、免疫組織化學(xué)等方法分析5-LO

5、基因在轉(zhuǎn)基因陽性小鼠各組織的轉(zhuǎn)錄特征和表達(dá)情況。
　　 結(jié)果
　　 重組質(zhì)粒經(jīng)酶切、測序等分析等均與預(yù)期相符,說明成功構(gòu)建了pEGFP-5-LO表達(dá)質(zhì)粒。通過G418篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染5-LO的RAW264.7細(xì)胞株,RT-PCR的方法檢測到5-LO mRNA的轉(zhuǎn)錄活性明顯較空白對照及轉(zhuǎn)染空載體pEGFP-C2的RAW264.7細(xì)胞增強(qiáng)(P<0.05),進(jìn)一步用Western-blot方法檢測到5-LO的蛋白表達(dá)水平明顯較空

6、白對照及轉(zhuǎn)染空載體pEGFP-C2的RAW264.7細(xì)胞增強(qiáng)(P<0.05),說明轉(zhuǎn)染成功并且5-LO基因得到表達(dá)。顯微注射166枚受精卵,并將90枚注射過的受精卵移植于3只ICR受體小鼠的輸卵管中,得到25只F0代轉(zhuǎn)基因小鼠。PCR、Southern雜交檢測轉(zhuǎn)基因陽性鼠7只,編號為1、9、13、17、20、22、24。應(yīng)用RT-PCR的方法檢測到轉(zhuǎn)基因小鼠的骨髓細(xì)胞、腹腔細(xì)胞、腎、脾組織5-LO、FLAP、及下游相關(guān)因子的mRNA較正

7、常鼠轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)。Western-blot方法分析得到轉(zhuǎn)基因陽性鼠骨髓細(xì)胞、腹腔細(xì)胞、腎、脾組織中5-LO、FLAP蛋白的表達(dá)明顯高于正常鼠(P<0.05)；免疫組織化學(xué)等方法分析得到在轉(zhuǎn)基因陽性鼠腎、脾組織中5-LO、FLAP蛋白的表達(dá)明顯高于正常鼠。
　　 結(jié)論
　　 pFGFP-5-LO質(zhì)粒體外穩(wěn)定轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞,可以有效地使5-LO在R NA水平和蛋白質(zhì)水平都具有較正常RAW264.7細(xì)胞的高表達(dá)；5-LO