pBC-rtTA轉(zhuǎn)基因小鼠模型的建立和應(yīng)用.pdf

1、四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)是對(duì)外源基因的表達(dá)水平進(jìn)行嚴(yán)格控制的一種轉(zhuǎn)基因技術(shù)，它能在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控轉(zhuǎn)入基因進(jìn)行組織特異或發(fā)育階段特異表達(dá)，同時(shí)還能控制其表達(dá)時(shí)間和表達(dá)量，就如在目的基因上加了個(gè)有效的“基因開關(guān)”。Tet-on系統(tǒng)中rtTA是反式四環(huán)素調(diào)控激活因子，它的作用跟tTA作用相反。Tet-on系統(tǒng)有效的調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。猿猴病毒40T抗原基因(SV40T)具有轉(zhuǎn)化動(dòng)物細(xì)胞和誘發(fā)腫瘤的特性。SV40Tag基因已被確認(rèn)為癌基因，SV40是基本

2、的病毒致癌物質(zhì)。 本研究利用分子生物學(xué)的基因克隆手段從tet-on載體上獲得片段rtTA，基因克隆進(jìn)乳腺特異性表達(dá)載體pBC中，成功構(gòu)建了重組基因pBC-rtTA，運(yùn)用雄原核顯微注射法制備轉(zhuǎn)基因小鼠，先后共注射477枚FVB小鼠受精卵，出生小鼠為117只，其中5只為pBC-rtTA轉(zhuǎn)基因陽性小鼠，顯微注射陽性率較高約為5％(5/117)為了避免PCR技術(shù)造成的假陽性存在，實(shí)驗(yàn)還進(jìn)行了Southernblotting，結(jié)果顯示5

3、只小鼠的基因pBC-rtTA都整合于DNA中，將5只轉(zhuǎn)基因首建鼠與正常FVB小鼠交配后，F(xiàn)1代外源基因pBC-rtTA的陽性率為50％，符合孟德爾遺傳定律，說明pBC-rtTA基因穩(wěn)定遺傳。將該小鼠與本實(shí)驗(yàn)室已有的轉(zhuǎn)基因小鼠TRE-SV40Tag進(jìn)行交配即四環(huán)素調(diào)控中反應(yīng)元件轉(zhuǎn)基因小鼠，共出生34只小鼠，PCR檢測(cè)：4只為雙陽性轉(zhuǎn)基因小鼠。其中31＃pBC-rtTA轉(zhuǎn)基因小鼠首建鼠其后代雙陽性小鼠經(jīng)強(qiáng)力霉素飲水的誘導(dǎo)35d后提取心、腦、