FGF9突變轉(zhuǎn)基因及基因敲入小鼠模型的建立與分析.pdf

1、本研究分為二部分： 第一部分、FGF9突變轉(zhuǎn)基因及基因敲入小鼠模型的建立與分析 在常染色體顯性遺傳病中，多發(fā)性骨性連接綜合征(SYNS)是一類少見的骨關(guān)節(jié)發(fā)育不全綜合征，表現(xiàn)為多處關(guān)節(jié)強(qiáng)直或融合。兒童期即可發(fā)病，并呈進(jìn)行性發(fā)展，最后發(fā)展為關(guān)節(jié)骨性融合。多發(fā)性骨性連接綜合征存在遺傳異質(zhì)性。迄今已報道的多發(fā)性骨性連接綜合征有二種類型，分別為由17號染色體的Noggin基因突變引起的SYNS1(MIM 186500)型和20號

2、染色體的生長分化因子-5(GDF5)基因突變引起的SYNS2(MIM 610017)型。 研究的前期工作對來自青海省一個由五代共56人組成的SYNS大家系進(jìn)行了候選基因連鎖分析和測序分析，排除了由NOG基因和GDF5基因致病的可能性，提出SYNS存在第三種遺傳異質(zhì)性，命名為SYNS3型。并最終確定這一家系的SYNS是由成纖維細(xì)胞生長因子(FGF9)基因突變所致。 FGF9是成纖維細(xì)胞生長因子（FGF）家族的成員之一，由2

3、08個氨基酸組成，其中在96～101位為一個非常保守的EFISIA基序。成纖維細(xì)胞生長因子受體（FGFR）屬于酪氨酸蛋白激酶家族，它們與成纖維細(xì)胞生長因子結(jié)合，在骨發(fā)育及損傷修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用。目前所知，F(xiàn)GF9及FGFR3的突變能引起軟骨發(fā)育不全、軟骨發(fā)育不足等一系列人類骨骼發(fā)育缺陷疾病。 本研究針對fgf9和主要的結(jié)合受體fgfr3在成年小鼠體內(nèi)的表達(dá)進(jìn)行了一系列實驗，發(fā)現(xiàn)fgf9在出生后的小鼠體內(nèi)主要表達(dá)于心臟、腦組織

4、、腎、骨骼肌和骨關(guān)節(jié)中，fgfr3的組織表達(dá)較fgf9更為廣泛一些。同時從實驗中可以看出，fgf9和fgfr3的表達(dá)情況在小鼠出生后不同年齡都不相同，但二者之間的表達(dá)較為一致。這些結(jié)果為研究FGF9突變導(dǎo)致多發(fā)性骨性連接綜合征發(fā)病機(jī)制奠定了一定的理論基礎(chǔ)，對研究工作有重要的意義。 同時，此前的體外實驗提示突變FGF9可能通過影響軟骨細(xì)胞的增殖及終末分化，進(jìn)而影響了軟骨內(nèi)骨化的過程。為進(jìn)一步研究FGF9在SYNS3型發(fā)生中的作用，

5、建立了在軟骨組織中特異性表達(dá)正常及突變FGF9 cDNA的轉(zhuǎn)基因小鼠。本研究利用RT-PCR和免疫組化及X光照射的手段，對已建立的轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行了表型分析，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因首建小鼠能將外源基因穩(wěn)定地傳遞到下一代。但在轉(zhuǎn)基因小鼠個體的研究中發(fā)現(xiàn)外源基因FGF9在RNA和蛋白質(zhì)水平都沒得到表達(dá)，也未出現(xiàn)異常表型。推測其原因可能是轉(zhuǎn)基因過程存在隨機(jī)性，會產(chǎn)生外源基因?qū)牒蟊怀聊默F(xiàn)象。此外，由于轉(zhuǎn)入的外源基因為人的FGF9基因，而在小鼠體內(nèi)本身也存

6、在內(nèi)源性的fgf9基因，導(dǎo)致轉(zhuǎn)入的FGF9基因受到競爭抑制而沒有表達(dá)。為此，課題組正在建立fgf9S99N單堿基突變敲入小鼠模型，以期更精確地模擬自發(fā)突變，研究突變FGF9對關(guān)節(jié)發(fā)育、軟骨增殖與分化的作用，進(jìn)而解釋由于單個堿基置換所導(dǎo)致的FGF9基因的生物學(xué)功能變化以及導(dǎo)致SYNS3型出現(xiàn)多發(fā)性骨性融合的可能機(jī)制，并為該病的基因診斷和基因治療奠定堅實的基礎(chǔ)。 第二部分、1700016G05Rik基因敲除小鼠模型的建立及表達(dá)譜分析

7、 RIKEN cDNA 1700016G05（1700016G05Rik）基因在小鼠基因組中位于6號染色體，共有6個外顯子組成。1700016G05Rik基因翻譯產(chǎn)物蛋白共237個氨基酸，為分泌性肽，預(yù)測該蛋白屬于酪氨酸樣絲氨酸蛋白激酶家族。NCBI上顯示該基因在小鼠中特異的高表達(dá)于成年小鼠的睪丸中。因此可預(yù)測，1700016G05Rik基因可能在小鼠的睪丸中發(fā)揮作用，對小鼠的精子生成等過程產(chǎn)生影響。 至今在國際上尚未有

8、對于1700016G05Rik基因研究的文獻(xiàn)報道，因此，擬建立基因敲除的小鼠模型，觀察1700016G05Rik基因的缺失對小鼠的表型是否產(chǎn)生影響，并可通過這些研究推測其在人體中的功能。目前，已得到嵌合體小鼠，現(xiàn)正與野生型小鼠交配中。同時，在RNA水平對1700016G05Rik基因在小鼠體內(nèi)的表達(dá)情況做了分析，證實該基因確實在成年小鼠睪丸內(nèi)特異性高表達(dá)，推測該基因可能在睪丸中發(fā)揮作用。這一發(fā)現(xiàn)對研究1700016G05Rik基因的功能