HSP22轉(zhuǎn)基因小鼠模型的建立.pdf

1、腓骨肌萎縮癥(CMT)又稱(chēng)為遺傳性運(yùn)動(dòng)感覺(jué)性神經(jīng)病(HMSN)，是最常見(jiàn)的遺傳性周?chē)窠?jīng)病，具有高度的臨床和遺傳異質(zhì)性，臨床上以肢體遠(yuǎn)端肌肉進(jìn)行性對(duì)稱(chēng)性的萎縮、無(wú)力、腱反射減弱和感覺(jué)減退等為主要特征，發(fā)病率約為1/2500。根據(jù)電生理和病理學(xué)特點(diǎn)，CMT可分為脫髓鞘型(CMT1)和軸索型(CMT2)，根據(jù)遺傳方式的不同，CMT可呈常染色體顯性遺傳(AD)、常染色體隱性遺傳(AR)和X連鎖遺傳(XD/XR)。隨著分子遺傳學(xué)的發(fā)展，迄今為止

2、，腓骨肌萎縮癥的基因型已達(dá)32型，其中22型已克隆。2004年，將一個(gè)來(lái)自中國(guó)湖南和湖北的常染色體顯性遺傳的CMT2型大家系定位在12q24.2-12q24.3之間的6.8cM區(qū)域，命名為CMT2L型(OMIM號(hào)608673)，隨后通過(guò)候選基因克隆策略，在該定位區(qū)間發(fā)現(xiàn)了小分子熱休克蛋白22基因(HSP22)的423G→T錯(cuò)義突變，導(dǎo)致氨基酸K141N的替換，與該CMT2L型家系的疾病表型共分離，從而證實(shí)HSP22為CMT2L型的致病基

3、因。 研究表明，CMT各亞型致病基因的分子發(fā)病機(jī)制并不完全一樣，可能通過(guò)致病基因的劑量效應(yīng)、功能喪失、功能獲得或顯性一負(fù)性作用而致病。國(guó)外研究表明，HSP22與HSP27存在蛋白-蛋白相互作用，而且還發(fā)現(xiàn)，HSP22可能與調(diào)節(jié)HSP27的活性有關(guān)，HSP22基因的K141N突變后并沒(méi)有破壞其編碼蛋白與HSP27的相互作用，相反，這種相互作用還增強(qiáng)了并且導(dǎo)致蛋白聚集物的形成，表明K141N突變可能是通過(guò)功能獲得作用而致病。為了證實(shí)

4、上述推測(cè)，擬應(yīng)用微纖維注射技術(shù)構(gòu)建HSP22基因K141N的轉(zhuǎn)基因小鼠模型，使小鼠攜帶人類(lèi)突變的HSP22蛋白，驗(yàn)證該突變的功能獲得作用。 最近的研究發(fā)現(xiàn)，HSP27突變后也可引起CMT，HSP22和HSP27基因突變可以引起同樣的疾病表型，這無(wú)疑為CMT發(fā)病機(jī)制的相關(guān)性研究提供了一個(gè)很好的線索和思路。通過(guò)對(duì)HSP27過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠模型進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)HSP27不僅對(duì)癲癇后的病理改變、心肌缺血和腦缺血之后的再灌注損傷都有保護(hù)作用

5、，而且對(duì)神經(jīng)損傷修復(fù)、肌肉功能的維持也有重要作用。HSP22是否具有同樣的功能，目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)系列的研究報(bào)道，也無(wú)關(guān)于HSP22的過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠構(gòu)建的報(bào)道。因此，為了更好的研究HSP22基因的功能及該基因突變后的分子致病機(jī)制，構(gòu)建HSP22的過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠模型是非常必要的。 為了構(gòu)建攜帶人類(lèi)HSP22基因K141N突變和野生型HSP22基因的轉(zhuǎn)基因小鼠模型，成功構(gòu)建了pCAGGS-HA-k141NHSP22和pCAGGS-H

6、A-wtHSP22兩個(gè)轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體。通過(guò)激光共聚焦顯微鏡和Western Blot分析，證實(shí)了pCAGGS-HA-k141NHSP22和pCAGGS-HA-wtHSP22可在真核細(xì)胞有效表達(dá)，并驗(yàn)證了K141N突變型HSP22在活體外細(xì)胞系中形成以核周分布為主的聚合物，野生型HSP22在活體外細(xì)胞系中彌散分布于胞漿和胞核內(nèi)。應(yīng)用HA單克隆抗體，可以特異性檢測(cè)出約25.5kDa大小的帶HA-tag的HSP22蛋白。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)pCAGG

7、S-HA-k141NHSP22和pCAGGS-HA-wtHSP22能用于轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建后，用SalⅠ、HindⅢ和BsaⅪ三個(gè)核酸內(nèi)切酶對(duì)pCAGGS-HA-k141NHSP22和pCAGGS-HA-wtHSP22進(jìn)行酶切得到線性化目的片段，然后進(jìn)行微纖維注射。pCAGGS-HA-k141NHSP22線性化片段進(jìn)行三次微纖維注射，共注射640枚受精卵，生下24只仔鼠，經(jīng)PCR和測(cè)序分析，獲得4只攜帶人類(lèi)HSP22基因K141N突變的轉(zhuǎn)

8、基因首建鼠，編號(hào)為T(mén)g642、Tg677、Tg679和Tg681。首建鼠Tg642已到交配年齡，使其與正常小鼠進(jìn)行交配，已生下3批共23只F1代小鼠，經(jīng)PCR鑒定，獲得4只攜帶人類(lèi)HSP22基因K141N突變的F1代轉(zhuǎn)基因小鼠，編號(hào)為Be423、Be435、Bf84和Bf86，經(jīng)Western Blot分析，該Tg642系小鼠并不表達(dá)目的蛋白，其他三個(gè)品系小鼠有待進(jìn)一步鑒定。pCAGGS-HA-wtHSP22線性化片段進(jìn)行一次微纖維注射

9、，共注射210枚受精卵，生下19只仔鼠，經(jīng)PCR和測(cè)序分析，獲得4只攜帶人類(lèi)HSP22基因的轉(zhuǎn)基因首建鼠，編號(hào)為T(mén)g646、Tg648、Tg649和Tg661。 在獲得更多pCAGGS-HA-k141NHSP22子代轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性小鼠的基礎(chǔ)上，將繼續(xù)進(jìn)行外源性突變HSP22蛋白的表達(dá)分析，如成功表達(dá)，再進(jìn)行下一步的行為學(xué)、電生理學(xué)和病理學(xué)等方面的分析，以期獲得CMT2L的轉(zhuǎn)基因小鼠模型，為CMT的分子發(fā)病機(jī)制和治療研究奠定基礎(chǔ)。在獲

10、得pCAGGS-HA-wtHSP22子代轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性小鼠的基礎(chǔ)上，分析外源性HSP22蛋白的過(guò)表達(dá)情況，如能得到過(guò)表達(dá)HSP22蛋白的轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性小鼠，后續(xù)的工作可圍繞HSP22的神經(jīng)保護(hù)作用進(jìn)行，例如用HSP22過(guò)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性小鼠與阿爾茨海默病(AD)、帕金森病(PD)、肌萎縮側(cè)索硬化癥(ALS)等神經(jīng)退行性疾病的小鼠模型進(jìn)行交配，也使這些神經(jīng)退行性疾病的小鼠模型過(guò)表達(dá)HSP22蛋白，觀察HSP22對(duì)上述神經(jīng)退行性疾病的病理改變是否有