小鼠轉(zhuǎn)基因干眼模型

1、小鼠轉(zhuǎn)基因干眼模型,小鼠轉(zhuǎn)基因干眼模型,SS的基礎研究，離不開一個恰當?shù)膭游锬Ｐ?。SS小鼠模型在研究SS病理、藥效等多方面都為一個強有為的工具。因此在過去的幾十年里，SS小鼠模型受到廣泛關注以及深入的研究，并取得一定的成果。小鼠與人的遺傳相似度十分高，并且其很適合做基因克隆與轉(zhuǎn)基因修改，因此可以用小鼠模型闡述人類SS等多種疾病發(fā)生機制。但是，使用小鼠來模擬人類SS的發(fā)生亦存在許多不足；例如，人與小鼠的居住環(huán)境差異，進化史的不同，人與

2、小鼠的固有免疫和適應性免疫間存在差異等。所以在我們使用小鼠模擬人類SS發(fā)生時，須注意SS小鼠僅能反映出SS的某一些或某一類的特征，而不能表現(xiàn)出其整個發(fā)病過程的特征。此外，由小鼠模型所得出的實驗數(shù)據(jù)應參考各品系小鼠不同的遺傳背景及各自特點進行綜合分析，這樣得出的實驗結(jié)果才真實可靠。下面主要從SS自發(fā)小鼠模型，基因工程SS小鼠模型，實驗誘導型SS小鼠模型三方面論述。,小鼠轉(zhuǎn)基因干眼模型,1.自發(fā)小鼠模型 ：許多SS自發(fā)模型小鼠都起源于非

3、爬胖糖尿病小鼠(NOD小鼠),其中包括N0D.B10-H26小鼠，C57BL/6小鼠，N0D-AeclAec2小鼠；其他品系的小鼠有NFS/sld小鼠，IQI/Jic小鼠以及Aly/aly小鼠。1.1.非肥胖糖尿病小鼠(NOD小鼠)NOD小鼠不僅是I型糖尿病自發(fā)模型小鼠，同時也是SS的自發(fā)模型小鼠。其自發(fā)I型糖尿病的主要機理是，NOD小鼠胰腺遭到淋巴細胞的浸潤而導致胰腺炎引起胰腺細胞破壞，最終導致膜島素的分泌不足。此外，NOD小

4、鼠具有獨特的主要組織相容性復合體(MHC)II類分子H-2g7而導致NOD小鼠疾病易感性增加。序列位點標記分析顯示NOD小鼠I型糖尿病的發(fā)生與MHC I-Ag7密切相關，但單個MHC I-Ag7不足以引起I型糖尿病的發(fā)生，表明亦有其他相關基因位點與自身免疫性糖尿病的發(fā)生有關。從4周齡開始NOD小鼠胰腺中CD4+T與CD8+T細胞浸潤明顯增加。然而，NOD小鼠胰腺破壞明顯，糖尿病癥狀突出則發(fā)生在14周齡左右。30周齡的雌性NOD小鼠發(fā)生

5、糖尿病的概率為60-80%,而雄性NOD小鼠發(fā)生糖尿病的概率為20-30%。,小鼠轉(zhuǎn)基因干眼模型,1.自發(fā)小鼠模型 ：1.1.非肥胖糖尿病小鼠(NOD小鼠)除了能夠在NOD小鼠胰腺中檢測到炎性細胞的浸潤，在外分泌腺中亦可發(fā)現(xiàn)淋巴細胞的浸潤而導致淚腺炎與涎腺炎。淚腺炎與涎腺炎的發(fā)生大約是在12周齡左右。除了淚腺炎與涎腺炎炎性細胞浸潤的病理與人類所發(fā)生的SS表現(xiàn)相似外，NOD小鼠血清中亦能產(chǎn)生多種與SS發(fā)生相關的自身抗體，例如抗核抗體

6、(ANA)，抗SSA/Ro，抗SSB/La，抗120KDaα-胞襯蛋白抗體，抗毒蕈堿受體3抗體以及胰島細胞自身抗體等。此外，據(jù)報道NOD小鼠血清及唾液腺中亦能找到一些與SS發(fā)生相關的細胞因子，例如IL-10，INF-γ，IL-7，MSCF，IL-17，IL-11，IL-5以及IL-8。由于NOD小鼠以上發(fā)病機制與人類高度相似，故其被作為一種主要的模型運用于SS的研究。,小鼠轉(zhuǎn)基因干眼模型,1.自發(fā)小鼠模型 ：1.2.N0D.B 1

7、0-H2b小鼠N0D.B 10-H2b小鼠主要用于原發(fā)性SS的研究。N0D.B 10-H2b小鼠的最大特點便是不再有I型糖尿病的發(fā)生，而僅表現(xiàn)出SS。因此N0D.B 10-H2b小鼠SS發(fā)生發(fā)展過程中將不再受I型糖尿病的影響。與人體的SS的發(fā)生相類似，N0D.B 10-H2b小鼠SS的發(fā)生主要表現(xiàn)為B淋巴細胞的異?；钴S，刺激B細胞的異常增殖，產(chǎn)生過多的自身抗體。有學者通過應用中華眼鏡蛇蛇毒因子干預N0D.B 10-H2b小鼠以探究

8、補體在N0D.B 10-H2b小鼠SS的發(fā)生中所起的作用發(fā)現(xiàn)，中華眼鏡蛇蛇毒因子由于能夠特異性阻斷C3分子而降低小鼠外分泌腺腺體淋巴細胞的浸潤以及結(jié)核抗體(ANA)的表達水平。亦有學者運用N0D.B 10-H2b小鼠探究性激素在SS發(fā)病過程中所起作用，表明卵巢切除的N0D.B 10-H2b小鼠患SS的幾率明顯上升且癥狀表現(xiàn)突出，經(jīng)激素替代療法后可得到明顯的改善。此外有報道顯示表沒食子兒茶沒食子酸醋及綠茶提取物皆能改善NOD與N0D.

9、B 10-H2b小鼠的SS。,小鼠轉(zhuǎn)基因干眼模型,1.自發(fā)小鼠模型 ：1.3.NOD其他衍生雜交小鼠許多其他NOD衍生雜交小鼠被用來檢測某些特定的基因與蛋白在原發(fā)性SS發(fā)病機制的作用。NOD.IFN-γ-/-與NOD.IFN-γ R-/-小鼠外分泌腺并沒有外分泌功能的損傷，表明IFN-γ是引發(fā)上皮細胞損傷的關鍵因素。NOD Igμ-/-小鼠被用來研究B淋巴細胞與自身抗體在引起SS外分泌腺外分泌功能下降的機理。NOD.IL4-/

10、-小鼠被用來探究TH1與TH2在引起SS唾液腺炎性細胞的浸潤與唾液腺外分泌功能降低所起到的作用，結(jié)果表明，雖然在NOD小鼠中可見到明顯的口腔干燥表現(xiàn)以及唾液腺中明顯的T淋巴細胞浸潤，但在NOD.IL4-/-小鼠并沒有出現(xiàn)口腔干燥的癥狀，表明TH1與TH2在引起SS小鼠口腔干燥起到?jīng)Q定作用。,小鼠轉(zhuǎn)基因干眼模型,1.自發(fā)小鼠模型 ：1.4.NFS/sld 小鼠基因突變NFS/sld小鼠具有抑制舌下腺分化的常染色體隱性基因，能夠影響腺體

11、中腺泡細胞分化成粘液分泌細胞。NFS/sld小鼠模型α-胞襯蛋白的異常水解是引起小鼠唾液腺損傷的最主要原因。胸腺切除的NFS/sld小鼠出現(xiàn)α-胞襯蛋白活化，在出生后3天即可出現(xiàn)SS樣表現(xiàn)，并且其淋巴細胞的浸潤僅局限于外分泌腺。浸潤的淋巴細胞主要為CD4+T淋巴細胞，而見少量的CD8+T淋巴細胞與B220+B淋巴細胞?；罨腃D4+T淋巴細胞則導致唾液腺中IFN-γ，IL-2，IL-10和IL-12p40 mRNA的表達升高。NFS

12、/sld小鼠外分泌腺中亦能檢測到導管上皮細胞抗體。NFS/sld小鼠體內(nèi)檢測到的120千道爾頓器官特異性的抗原與人體內(nèi)的α-胞襯蛋白序列是相一致的。但是當利用免疫熒光標記法檢測SS患者血清時，抗α-胞襯蛋白自身抗體與抗SSA/Ro自身抗體和抗SSB/La自身抗體相比靈敏度與特異性相差較大。,小鼠轉(zhuǎn)基因干眼模型,1.自發(fā)小鼠模型 ：1.4.NFS/sld 小鼠到目前為止基因突變NFS/sld小鼠己被運用于多項研究SS發(fā)病機理的研究中。

13、利用常規(guī)劑量的2,3,7,8-四氯二苯并二惡英干預新生NFS/sld小鼠以探討環(huán)境因素在引發(fā)SS過程中所起到的作用，結(jié)果顯示2,3,7,8-四氯二苯并二惡英干預后的NFS/sld小鼠唾液腺及其他外分泌腺體中能夠觀察到明顯的淋巴細胞浸潤。口服粘膜保護劑瑞己匹特(a-[(4-氯苯甲?；?氨基]-1,2-二氫-2-氧代-4-喹啉丙酸)能夠抑制CD4+T的活性及TH1的產(chǎn)生從而降低了自身抗體的產(chǎn)生。實驗證實免疫抑制劑環(huán)孢霉素能夠明顯改善N

14、FS/sld小鼠眼干的癥狀。從金線吊烏龜中生物堿千金藤素能夠抑制NFS/sld小鼠中性粒細胞的活性，防止腺泡細胞損傷。,小鼠轉(zhuǎn)基因干眼模型,1.自發(fā)小鼠模型 ：1.5.IQI/Jic 小鼠和NOD小鼠一樣，IQI/Jic小鼠也是從ICR小鼠培育而來。6月齡的IQI/Jic小鼠唾液腺及淚腺中能夠見到明顯的淋巴細胞浸潤灶，并且在雌性IQI/Jic小鼠胸腺中B細胞數(shù)量明顯增多。組織病理學發(fā)現(xiàn)IQI/Jic小鼠不光在外分泌腺腺體中能見到明

15、顯的淋巴細胞浸潤，在其他非分泌性器官中亦能見到顯著的淋巴細胞浸潤，例如腎臟、胰腺、肺臟等。值得注意的是在IQI/Jic小鼠血清中僅能檢測到結(jié)核抗體的表達水平升高而自身抗SSA/Ro與SSB/La并沒有檢測到異常。涎腺炎發(fā)生在雌性IQI/Jic小鼠的各年齡段，且隨著小鼠年齡的增長涎腺炎癥狀逐漸加重；而雄性IQI/Jic小鼠涎腺炎的發(fā)病較輕且與年齡無關。與人體發(fā)生SS特征相似，CD4+T細胞所造成的外分泌腺體破壞較輕，而B220+B則能引

16、起外分泌腺大范圍的炎性細胞浸潤。研究表明IQI/Jic小鼠體內(nèi)T淋巴細胞活性的增強能夠增加器官內(nèi)Klk-13(激肽釋放酶-13)的產(chǎn)生，因此Klk-13的過多產(chǎn)生可能是IQI/Jic小鼠出現(xiàn)SS樣表現(xiàn)的重要原因之一。,小鼠轉(zhuǎn)基因干眼模型,1.自發(fā)小鼠模型 ：1.5.IQI/Jic 小鼠盡管直到8周齡左右雌性IQI/Jic小鼠頜下腺與雄性IQI/Jic小鼠淚腺中才檢測到明顯的淋巴細胞浸潤，但大約在小鼠四周齡左右便可在頜下腺與淚腺中檢

17、測到MHCII型分子，CD11c+與CD86+樹突狀細胞的存在，表明樹突狀細胞與表皮細胞可能是參與激活CD4+T細胞的關鍵因素。胸腺切除的IQI/Jic小鼠在出生后3天便可出現(xiàn)嚴重的淚腺損傷，其損傷嚴重度與未進行胸腺切除術16周齡的IQI/Jic小鼠相仿，這一結(jié)果表明年輕的IQI/Jic小鼠體內(nèi)的免疫調(diào)節(jié)性T細胞可能對IQI/Jic小鼠自身免疫紊亂起到一定的調(diào)節(jié)作用。最近研究表明伴隨著IQI/Jic小鼠頜下腺腺體淋巴細胞的浸潤與功能

18、的紊亂，腺泡細胞中存在著AQP5的分布異常。,小鼠轉(zhuǎn)基因干眼模型,1.自發(fā)小鼠模型 ：1.6.Aly/aly 小鼠Aly/aly小鼠主要是由于常染色體純合子隱性基因突變而導致淋巴組織發(fā)育不全，表現(xiàn)為系統(tǒng)性淋巴結(jié)與集合淋巴結(jié)的缺失，脾臟與胸腺結(jié)構(gòu)紊亂。Aly/aly小鼠在14周齡時開始自發(fā)的出現(xiàn)唾液腺以及涎腺炎癥，并隨著年齡的増長而逐漸加重。組織病理學觀察發(fā)現(xiàn)，其炎性細胞的浸潤主要以CD4+T細胞為主，浸潤特征為由導管周圍區(qū)域向腺泡

19、小葉逐漸擴散。Aly/aly小鼠的發(fā)病特點是淚腺浸潤損傷情況比唾液腺更為嚴重，唾液腺中淋巴細胞浸潤損害較輕，有時甚至無淋巴細胞的浸潤。,小鼠轉(zhuǎn)基因干眼模型,2.基因工程模型小鼠：轉(zhuǎn)基因與基因敲除鼠 ：2.1.Id3 K0 小鼠轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子Id3能夠抑制堿性螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合從而對免疫細胞及非免疫細胞的增殖及分化起到調(diào)節(jié)作用。Id3同時也參與T淋己細胞的選擇與分化的信號轉(zhuǎn)導。Id3 K0 小鼠的基本特征為免

20、疫系統(tǒng)的改變，結(jié)外邊緣區(qū)B細胞的增殖，前B細胞殘存以及出現(xiàn)MHC限制性。并且這一品系的小鼠將出現(xiàn)與人類相類似的SS。Id3 K0 小鼠在八周齡唾液腺與淚腺導管和血管周圍將出現(xiàn)淋巴細胞的浸潤，并且隨著年齡的增長浸潤情況將加重。6至12月齡時淚腺與唾液腺將只表現(xiàn)為CD4+T淋巴細胞的浸潤，12月齡左右時可在血清中檢測到抗SSA/Ro與SSB/La抗體陽性。值得注意的是此系列小鼠早在6到18周齡時便會出現(xiàn)SS樣表現(xiàn)，但此時小鼠的外分泌腺并未

21、遭到破壞并且此時小鼠血清檢查也未發(fā)現(xiàn)異常的自身抗體，表明SS的發(fā)病還有其他因素起作用。,小鼠轉(zhuǎn)基因干眼模型,2.基因工程模型小鼠：轉(zhuǎn)基因與基因敲除鼠 ：2.2.Ar K0 小鼠通常情況下，女性出現(xiàn)自身免疫性疾病的概率與男性相比明顯要高，表明雌性激素在自身免疫性疾病的發(fā)生過程中能起到重要作用。實驗證明雌性激素替代療法能夠明顯降低卵巢切除小鼠SS的發(fā)病?？诜菩约に啬軌蛎黠@減輕雌激素缺乏小鼠T淋巴細胞所介導的涎腺炎以及防止涎腺細胞的調(diào)

22、亡。然而，尚沒有有關SS小鼠雌性激素受體缺乏的報道。芳香化酶(Ar)基因主要是調(diào)控雌性激素的產(chǎn)生，芳香化酶基因敲除小鼠在12周齡時會表現(xiàn)出T淋巴細胞的異常增生并且出現(xiàn)SS相類似的表現(xiàn)。這一類小鼠發(fā)病的特征是以B220+細胞浸潤為主，導致腺泡細胞結(jié)構(gòu)的破壞以及唾液腺功能的損傷。Ar K0小鼠血清中抗α-胞襯蛋白抗體化及α-胞襯蛋白水解片段與SS患者組織損傷相類似。ArK0小鼠體內(nèi)并不能檢測到抗核抗體。,小鼠轉(zhuǎn)基因干眼模型,2.基因工

23、程模型小鼠：轉(zhuǎn)基因與基因敲除鼠 ：2.2.Ar K0 小鼠在ArK0小鼠體內(nèi)可發(fā)現(xiàn)輕度的脾腫大，骨髓中見有異常的B淋巴細胞增生。對雌激素缺乏所引起的SS小鼠發(fā)病機制的研究表明使用雌激素，大豆異黃酮等對這一類型的SS進行治療將有可能有效。Rahimi Darabad R等研究表明雌激素缺乏的Ar K0年輕小鼠雖然會影響其與雌激素相關的淚腺特異性基因的表達，但其并不會表現(xiàn)出SS相關表現(xiàn)。這些研究也許表明Ar K0小鼠尤其是年輕小鼠淚腺

24、功能與結(jié)構(gòu)的變化除了受雌性激素的不足影響外亦受其他因素的影響。,小鼠轉(zhuǎn)基因干眼模型,3.實驗誘導型小鼠模型：3.1.Ro抗原免疫誘導反復對BALB/c小鼠腹腔進行60KDa Ro 自身抗原注射能夠引起表位擴展，出現(xiàn)一些與SS相類似的臨床表現(xiàn)。例如出現(xiàn)唾液腺遭到淋巴細胞的浸潤，口腔干燥等表現(xiàn)。其唾液腺中所浸潤的淋巴細胞主要包括:45%CD4+T細胞,18%CD8+T細胞,35%CD19+B細胞等。小鼠38周齡時在小鼠體內(nèi)可檢測到抗

25、SSA/Ro與抗SSB/La抗體的產(chǎn)生。到目前為止Ro自身抗體引起小鼠SS的發(fā)病機制尚有爭論。此類SS小鼠模型最大的缺點是BALB/c小鼠需反復進行腹腔注射Ro自身抗原五個月上才能成模。,小鼠轉(zhuǎn)基因干眼模型,3.實驗誘導型小鼠模型：3.1.Ro抗原免疫誘導有研究顯示使用自身抗原Ro60干預不同品系的小鼠，所得到的結(jié)果不盡相同。SJL/J小鼠對Ro60的刺激并不產(chǎn)生免疫反應；C57BL/6小鼠經(jīng)Ro60刺激后雖有自身抗體的產(chǎn)生但并

26、不能觀察到表位擴展現(xiàn)象。并且SJL/J，C57BL/6與PL/J小鼠外分泌腺均未出現(xiàn)淋巴細胞浸潤情況以及外分泌腺功能喪失。DBA-2與BALB/c小鼠外分泌腺均能出現(xiàn)淋巴細胞的浸潤，但只有BALB/c小鼠外分泌功能下降。,小鼠轉(zhuǎn)基因干眼模型,小鼠轉(zhuǎn)基因干眼模型,3.實驗誘導型小鼠模型：3.3.CAⅡ免疫誘導碳酸酐酶(CAⅡ)是一種鋅酶，其主要的功能是催化二氧化碳可逆的水合作用。盡管機體內(nèi)碳酸酐酶抗體是自身免疫性胰腺炎的典型表現(xiàn)，