microrna31轉(zhuǎn)基因小鼠與昆明小鼠脊髓損傷模型胃腸動(dòng)力變化的研究

1、microRNA-31轉(zhuǎn)基因小鼠與昆明小鼠脊髓損傷模型胃腸動(dòng)力變化的研究,導(dǎo) 師：閆 軍 研 究 生：王德君 專(zhuān) 業(yè)：普通外科,目錄,一、研究背景二、研究?jī)?nèi)容及其意義三、研究方案四、實(shí)驗(yàn)特色與創(chuàng)新五、研究基礎(chǔ)與條件六、預(yù)期研究成果七、研究計(jì)劃八、經(jīng)費(fèi)預(yù)算九、參考文獻(xiàn),研究背景,近年來(lái)，隨著交通和建筑業(yè)的迅速發(fā)展，脊柱骨折合并脊髓損傷（Spinal cord

2、injury,SCI）已成為骨科領(lǐng)域中常見(jiàn)的疾患。據(jù)統(tǒng)計(jì)發(fā)達(dá)國(guó)家的SCI發(fā)病率為28.3-45人/百萬(wàn)人/年，我國(guó)發(fā)病率雖較低，約6.7人/百萬(wàn)年/年，但每年也有1萬(wàn)余人遭此損傷，且以中青年胸腰段損傷最多。脊髓損傷治療困難，終身殘疾率較高，給社會(huì)和家庭帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)。SCI后患者將要面對(duì)五項(xiàng)主要的問(wèn)題：行走能力、大便控制、小便控制、性功能、疼痛，如何處理好這些問(wèn)題仍是難題。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)SCI后疼痛、行走能力的處理、尿動(dòng)力等多方面的研

3、究較多，并取得一定的進(jìn)展。與之相比，SCI后胃腸功能紊亂和排便功能障礙并沒(méi)有得到足夠的重視，而該問(wèn)題會(huì)對(duì)患者的日常生活能力和回歸社會(huì)產(chǎn)生終身影響，給患者的生活、家庭及社會(huì),研究背景,造成巨大的負(fù)擔(dān)。多項(xiàng)研究表明，在SCI穩(wěn)定以后，胃腸道功能紊亂可導(dǎo)致患者一系列的問(wèn)題：獨(dú)立排便障礙、便秘、腹脹大便失禁、排便耗時(shí)明顯延長(zhǎng)、飲食受限、戶(hù)外活動(dòng)受限、精神壓力乃至影響壽命等。研究表明：胃腸運(yùn)動(dòng)是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)、植物神經(jīng)系統(tǒng)及內(nèi)源性腸神經(jīng)系統(tǒng)的參與

4、下進(jìn)行的。其運(yùn)動(dòng)主要有中樞神經(jīng)系統(tǒng)來(lái)完成，植物神經(jīng)系統(tǒng)及內(nèi)源性腸神經(jīng)系統(tǒng)起調(diào)整作用。這三部分任何一部分的異常都將導(dǎo)致疾病的產(chǎn)生。有“腸腦”之稱(chēng)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)是胃腸調(diào)節(jié)機(jī)制中的決定性環(huán)節(jié)。腸神經(jīng)系統(tǒng)是由胃腸道、膽道及胰腺中所含的神經(jīng)節(jié)及其間的神經(jīng)纖維組成，控制著胃腸道的運(yùn)動(dòng)、分泌、血流及物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)功能，并把胃腸與中樞神經(jīng)系統(tǒng)及植物神經(jīng)系統(tǒng)聯(lián)系起來(lái)。腸道內(nèi)神經(jīng)末梢釋放的化學(xué)物質(zhì)較為復(fù)雜，與運(yùn)動(dòng)有關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì)主要有血管,研究背景,活性腸肽、一氧

5、化氮、乙酰膽堿、P物質(zhì)等。而胃動(dòng)素受體、生長(zhǎng)抑素受體在腸神經(jīng)系統(tǒng)都有分布，提示胃動(dòng)素和生長(zhǎng)抑素的作用是通過(guò)神經(jīng)系統(tǒng)通路和對(duì)平滑肌的直接作用共同來(lái)完成的。研究表明，miR-31在維持神經(jīng)干細(xì)胞增殖中起著比較重要的作用。從而我們可以利用microRNA-31對(duì)脊髓損傷有修復(fù)作用來(lái)研究SCI后microRNA-31轉(zhuǎn)基因小鼠胃腸動(dòng)力變化與昆明小鼠胃腸動(dòng)力變化的差異。研究SCI后的胃腸功能障礙對(duì)提高患者生活質(zhì)量、重返社會(huì)、延長(zhǎng)壽命具有重要意義。

6、研究目的：利用microRNA對(duì)脊髓損傷有修復(fù)作用來(lái)研究SCI后microRNA轉(zhuǎn)基因小鼠胃腸動(dòng)力變化與昆明小鼠胃腸動(dòng)力變化的差異。,研究?jī)?nèi)容及其意義,本研究的主要內(nèi)容是：1、脊髓損傷后胃腸動(dòng)力的改變；2、影響胃腸動(dòng)力的兩大主要激素：胃動(dòng)素和生長(zhǎng)抑素3、胃竇MTL-R1A mRNA和結(jié)腸SSTR2 mRNA的表達(dá)研究SCI后的胃腸功能障礙對(duì)提高患者生活質(zhì)量、重返社會(huì)、延長(zhǎng)壽命具有重要意義。,研究方案,實(shí)驗(yàn)思考技術(shù)路線(xiàn)圖實(shí)驗(yàn)

7、方法擬解決的關(guān)鍵技術(shù)問(wèn)題,實(shí)驗(yàn)思考,臨床——基礎(chǔ)研究——臨床microRNA-31 胃動(dòng)素 脊髓損傷 和生長(zhǎng)抑素 轉(zhuǎn)基因小鼠 的變化,,,,,隨機(jī)分組,技術(shù)路線(xiàn)圖,microRNA-31轉(zhuǎn)基因小鼠,脊髓損傷,對(duì)照組,于第3d、7d、14d分別處死2只,,胃排空和小腸推進(jìn)

8、率脊髓組織病理觀察、胃竇MTL-R1A 和結(jié)腸SSTR2 的mRNA的表達(dá),,,,,,同前,,同前,昆明小鼠,,,,,脊髓損傷,對(duì)照組,,,于第3d、7d、14d分別處死2只,同前,,,胃排空和小腸推進(jìn)率胃竇MTL-R1A 和結(jié)腸SSTR2 的mRNA的表達(dá),同前,,,,造模,,,實(shí)驗(yàn)方法,1 脊髓損傷模型的建立： 用脊髓打擊器建立脊髓損傷模型，采用BBB 評(píng) 分法，選擇BBB評(píng)分0分的小鼠為造模成功2

9、 小鼠的運(yùn)動(dòng)能力評(píng)定： 采用改良后CBS法進(jìn)行動(dòng)物運(yùn)動(dòng)行為評(píng)分，觀察 指標(biāo)包括開(kāi)放空間運(yùn)動(dòng)能力、腳趾伸展、觸地 反射、回縮反射、翻正反射、斜板試驗(yàn)。并且 對(duì)小鼠雙后肢的運(yùn)動(dòng)功能觀察，采用BBB評(píng)分,3 分組： 取microRNA-31轉(zhuǎn)基因小鼠和昆明小鼠各20雌雄不拘，將microRNA-31轉(zhuǎn)基因小鼠隨機(jī)分為兩組，其中對(duì)照組10只，脊髓損傷組10只，將昆明小鼠隨機(jī)分為兩組，其中對(duì)照組10只，脊髓

10、損傷組10只,（1）昆明小鼠脊髓損傷組：分別于脊髓損傷后第3d、7d、14d進(jìn)行胃排空和小腸推進(jìn)率檢測(cè)、脊髓組織病理觀察、RT-PCR法檢測(cè)胃竇MTL-R1A mRNA和結(jié)腸SSTR2 mRNA的表達(dá)。（2）昆明小鼠對(duì)照組：分別于昆明小鼠造模組脊髓損傷后第3d、7d、14d進(jìn)行胃排空和小腸推進(jìn)率檢測(cè)、脊髓組織病理觀察、RT-PCR法檢測(cè)胃竇MTL-R1A mRNA和結(jié)腸SSTR2 mRNA的表達(dá)。,（3）microRNA-31轉(zhuǎn)基因小

11、鼠脊髓損傷組：分別于脊髓損傷后第3d、7d、14d進(jìn)行胃排空和小腸推進(jìn)率檢測(cè)、脊髓組織病理觀察、RT-PCR法檢測(cè)胃竇MTL-R1A mRNA和結(jié)腸SSTR2 mRNA的表達(dá)。（4）microRNA-31轉(zhuǎn)基因小鼠對(duì)照組：分別于microRNA-31轉(zhuǎn)基因小鼠脊髓損傷后第3d、7d、14d進(jìn)行胃排空和小腸推進(jìn)率檢測(cè)、脊髓組織病理觀察、RT-PCR法檢測(cè)胃竇MTL-R1A mRNA和結(jié)腸SSTR2 mRNA的表達(dá)。,,脊髓組織病理觀察：

12、 于造模后第3d、7d、14d,正常組和造模組各隨機(jī)抽取2只小鼠處死，以T11為中心取長(zhǎng)約1.0cm的脊髓，以4%多聚甲醛固定24小時(shí)后，常規(guī)石蠟包埋，性HE染色，觀察脊髓組織形態(tài)學(xué)變化。,,胃排空和小腸推進(jìn)率檢測(cè)：各組小鼠于造模后第7天，各組隨機(jī)抽取2只小鼠，每組灌服混有99m礙-二乙三胺五乙酸（99mTC-DTPA）0.05毫居（mCi）/10g和少量亞甲藍(lán)的營(yíng)養(yǎng)性半固體糊標(biāo)準(zhǔn)餐20ml/kg胃內(nèi)核素殘留率（%）=（胃

13、內(nèi)核素殘留值/基準(zhǔn)值）*100%小腸推進(jìn)率（%）=（幽門(mén)括約肌至色素前端的距離（cm）/幽門(mén)括約肌至回盲部的距離（cm））*100%,,RT-PCR法檢測(cè)胃竇MTL-R1A mRNA和結(jié)腸SSTR2 mRNA的表達(dá)： 造模后第3d、7d、14d，對(duì)照組和脊髓損傷組各隨機(jī)抽取2只小鼠處死，取1cm胃竇和結(jié)腸組織，用RT-PCR法檢測(cè)胃竇MTL-R1A mRNA和結(jié)腸SSTR2 mRNA的表達(dá),統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：,計(jì)量資料多組間均值的比較

14、先采用單因素方差分析，方差齊時(shí)，以均值加減標(biāo)準(zhǔn)差（X±S）表示，組間的均值兩兩比較用SNK法（q檢驗(yàn)）；自身前后均值比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。以上數(shù)據(jù)由SPPS16.0完成統(tǒng)計(jì)，α=0.05,關(guān)鍵技術(shù),1、脊髓損傷模型的建立2、胃排空和小腸推進(jìn)率檢測(cè)3、RT-PCR法檢測(cè)胃竇MTL-R1A mRNA和結(jié)腸SSTR2 mRNA的表達(dá),本項(xiàng)目的特色與創(chuàng)新之處,本課題首次探討microRNA-31轉(zhuǎn)基因小鼠脊髓損傷后胃腸動(dòng)力的變化,研

15、究基礎(chǔ)及條件,1.閆軍主任、王春芳教授具有豐富的科研和臨床經(jīng)驗(yàn)。2.以查閱多篇國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)，并已基本掌握實(shí)驗(yàn)所需各項(xiàng)操作技能。3.山西醫(yī)科大學(xué)王春芳教授實(shí)驗(yàn)室完全滿(mǎn)足完成本實(shí)驗(yàn)的條件。4.實(shí)驗(yàn)室有專(zhuān)業(yè)的指導(dǎo)老師指導(dǎo)以保證課題的順利進(jìn)行。5.相關(guān)的資金已經(jīng)到位,預(yù)期研究成果,預(yù)計(jì)microRNA-31轉(zhuǎn)基因小鼠脊髓損傷后胃動(dòng)素先下降后上升，生長(zhǎng)抑素先上升后下降，昆明小鼠脊髓損傷后胃動(dòng)素呈下降趨勢(shì)，生長(zhǎng)抑素呈上升趨勢(shì)通過(guò)此研究

16、預(yù)計(jì)發(fā)表論文1-2篇。,研究計(jì)劃,2015年3月—2015年4月：查資料，寫(xiě)綜述及開(kāi)題報(bào)告。2015年4月—2015年6月：前期準(zhǔn)備工作，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、耗材試劑購(gòu)買(mǎi)，部分預(yù)試驗(yàn)。2015年7月—2015年9月：動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，分子生物學(xué)檢測(cè)。2015年10月—2015年12月：數(shù)據(jù)整理、論文書(shū)寫(xiě).,經(jīng)費(fèi)預(yù)算,1、動(dòng)物造模費(fèi)用 5002、試劑及儀器使用費(fèi)用 30003、耗材費(fèi)用 100

17、04、出版費(fèi)用 3000,參考文獻(xiàn),Kelly SR，Shashidharan M，Borwell B，et al. The role of intestinal stoma in patients with spinal cord injury【J】.Spinal Cord，1999,37（3）：213-214.Han TR，Kim JH，Kwon BS. Chronic ga

18、strointestinal problems and bowl dysfunction in patients with spinal cord injury【J】. .Spinal Cord，1998,36（7）：485-490.,參考文獻(xiàn),Steven AS，Susan BB，Lance LG. Neurogenic bowel dysfunction after spinal cord

19、injury ： clinical evalution and rehabilitative management【J】.Arch Phys Med Rehabil ，1997,78：S86-S102.Tatagiba M，Brosamle C，Schwab ME. Regeneration of injury axons in the adult mammalian central nerv

20、ous system. Neurlsurg，1997；40:541-547.,參考文獻(xiàn),張三印，蕫宇，楊鵬.胃腸運(yùn)動(dòng)障礙發(fā)病機(jī)制與證治.中醫(yī)藥學(xué)刊，2003；21（2）：209-211.陸英杰，連至誠(chéng).胃腸激素對(duì)胃腸動(dòng)力的影響.中國(guó)熱帶醫(yī)學(xué)，2005；5（6）：1338-1339.Zamore PD，Haley B. Ribo-gnome：the big world of small RNAs[J].Science

21、,2005,309(5740):15-19.,參考文獻(xiàn),Banwell H, Greasey G. Management of neurogenic bowel in the petients with spinal cord injury[J]. Urol Clin N Am,1993,94(3):773-779.曹靜宜，周?chē)?guó)昌.脊髓損傷患者的結(jié)腸通過(guò)時(shí)間測(cè)定【J】.中外民醫(yī)雜志.2001,2:1