轉基因小鼠技術

1、轉基因小鼠技術 ---轉基因小鼠的構建,2,,基因打靶的簡易程序,3,優(yōu)點：外源基因整合情況的可控性高可預先在細胞水平檢測外源基因的拷貝數(shù)、定位、表達的水平及插入的穩(wěn)定性外源基因導入ES細胞的方法多樣，細胞鑒定及篩選方便缺點：ES細胞系建立及培養(yǎng)困難維持ES細胞的未分化及多向分化潛能不易所得個體為嵌合體,胚胎干細胞（ES細胞）法,2024/3/5,4,2024/3/5,5,主要是利用反轉錄病毒的長末端重復

2、序列(LTR)區(qū)域具有轉錄啟動子活性的特點,將外源基因連接到LTR下游進行基因重組后,再包裝成為高滴度病毒顆粒,去直接感染受精卵或顯微注入囊胚腔中,攜帶外源基因的反轉錄病毒DNA可以整合到宿主染色體上。,3、逆轉錄病毒感染法,6,3、逆轉錄病毒感染法,優(yōu)點由于反轉錄病毒的高效率感染和在宿主細胞DNA中的高度整合特性, 大大提高基因轉移的效率細菌質(zhì)粒和噬菌體載體只能將目的基因運載至細菌中擴增和表達。病毒載體是較理想的真核基因工程載體

3、缺點獲得純合體的轉基因動物的機會少病毒載體構建復雜轉入的外源基因的大小受到限制, <10kb轉入病毒自身基因的復制表達,2024/3/5,7,4、體細胞核移植法,首先將目標基因轉移到體外培育的動物體細胞中,篩選出陽性轉基因細胞并進行繁殖,制備出供移植用的細胞核供體。然后將轉基因細胞核供體移植到去核的卵母細胞中,重構胚胎經(jīng)過激活和培養(yǎng)后,移植到代孕小鼠中1997 年, 英國Roslin 研究所的Wilmut等利用成年綿羊

4、乳腺上皮細胞作為核供體,成功獲得了體細胞克隆綿羊多莉(Dolly) ,拉開了動物體細胞克隆技術的序幕。,2024/3/5,8,顯微法和克隆法效率比較,1997 Nature 385, 810–813,4、體細胞核移植法,2024/3/5,9,優(yōu)點減少受體動物的數(shù)目,不需要用受體母畜來承擔那些非轉基因的胚胎,表現(xiàn)了強大的生命力。事先在細胞中進行基因轉移和對陽性細胞進行篩選,簡化了轉基因動物生產(chǎn)的許多環(huán)節(jié),節(jié)約了人力,具有很大的優(yōu)越性。

5、缺點體細胞克隆技術近年來發(fā)展勢頭十分迅猛,但在基礎理論和實驗技術上還需進一步探索。,4、體細胞核移植法,2024/3/5,10,5、精子載體法,將精子與外源DNA進行預培養(yǎng)之后,使精子有能力攜帶外源基因進入卵中,受精后進行胚胎移植,這樣產(chǎn)生的動物也會使外源基因得到表達。精子攜帶DNA的途徑外源DNA與精子共孵育電穿孔導入法脂質(zhì)體轉染法,2024/3/5,11,優(yōu)點基因轉化方法簡便,效率高動物育種不經(jīng)過嵌合體,實驗

6、周期短缺點目的基因整合的隨機性無法早期驗證修飾事件成功率不高、效果不穩(wěn)定,5、精子載體法,2024/3/5,12,6、YAC法（人工酵母染色體法）,優(yōu)點：克隆百萬堿基對(Mbp) 級的大片段外源DNA 的能力,可以保證巨大基因的完整性; 保證所有順式作用因子的完整并與結構基因的位置關系不變;保證較長的外源基因片段在轉基因動物研究中整合率的提高; 鑒于基因的完整性,目的基因上下游的側翼序列可以消除或減弱基因整合的位置效率。

7、缺點：不穩(wěn)定，制備工藝繁瑣。,2024/3/5,13,7、BAC法（人工細菌染色體法）,建立在大腸桿菌的F因子上的BAC載體：外源DNA可>300kb。F因子（F質(zhì)粒）是一種“性質(zhì)?！?，可轉移至F-宿主細胞。100kb,近百個蛋白質(zhì)?？蓸嫿˙AC文庫；有單一的loxp位點，利于圖譜分析（借助標記loxp和cre 重組酶； BAC載體兩端有Sp6和T7 引物序列利于測序，確定基因的 染色體定位；可穩(wěn)定遺傳，易于

8、操作。BAC文庫：基因組酶切后100～300kbDNA+BAC?大腸桿菌,2024/3/5,14,基因轉移方法的比較,2024/3/5,15,,Electroporation,2024/3/5,16,電擊儀,2024/3/5,17,2024/3/5,18,2024/3/5,19,2024/3/5,20,2024/3/5,21,2024/3/5,22,,2024/3/5,23,2024/3/5,24,2024/3/5,25,轉基因小鼠技

9、術---轉基因小鼠在科研中的應用,2024/3/5,26,1. 7500萬－1.25億年前 -- 人鼠始祖,小鼠的歷史,2. 19世紀 -- 寵物鼠---實驗鼠的“先驅”,3. 1897年 -- 重組表型,2024/3/5,27,,4. 1900年 -- 從寵物鼠到實驗鼠,Abbie Lathrop----飼養(yǎng)寵物鼠1902年，William Ernest Castle購買老鼠，用于遺傳學研究。哈佛大學---老鼠的毛色進行觀察，以檢

10、測孟德爾法則的正確性。,小鼠的歷史,5. 1905年 -- 孟德爾老鼠,通過對黃白相間的雜色鼠進行研究，法國遺傳學家Lucien Claude Cuéno 發(fā)現(xiàn)，兩個攜帶黃色皮毛基因的老鼠之間交配，其子代老鼠中黃色老鼠和白色老鼠的數(shù)量比總是2:1。--這是報道的第一個等位純合致死的基因。,2024/3/5,28,Clarence Cook Little是一個來自于William Castle 實驗室的哈佛大學生物學家，他培育出

11、了第一個近親繁殖的小鼠株系――DBA。,小鼠的歷史,6. 1909年 -- 實驗鼠的誕生,Clarence Little 和 Ernest Tyzzer 發(fā)現(xiàn)在同一株系小鼠間進行腫瘤移植不會產(chǎn)生排斥現(xiàn)象，但不同株系間的移植則會發(fā)生排斥反應。,7. 1916年 -- 腫瘤易受性和組織相容性,Jackson實驗室的George Snell在1940年代發(fā)現(xiàn)了組織相容性基因---榮獲了1980年的諾貝爾獎,2024/3/5,29,8. 192

12、1年 -- C57BL株系,基因組測序在2002年完成,小鼠的歷史,9. 1929年 -- Jackson 實驗室 ---世界上最重要的小鼠遺傳學研究中心,在Hudson 汽車公司的頭目Edsel Ford和Roscoe Jackson兩位大財主的資助下，Charence Little 在美國緬因州Bar Harbor 建立了Jackson 實驗室,2024/3/5,30,10. 1953年 -- DNA雙螺旋,Crick，Watso

13、n和Wilkins三人因為這項杰出的成就榮獲了1962年的諾貝爾獎。,11. 1966年 -- 遺傳密碼破譯,Robert Holly，Har Gobind Khorana 和 Marshall Nirenberg 破譯了遺傳密碼---1968年的諾貝爾獎,小鼠的歷史,2024/3/5,31,12. 1972年 --- 小鼠遺傳學的計算機數(shù)據(jù)庫,Jackson 實驗室設計了第一個哺乳動物遺傳學計算機數(shù)據(jù)庫,13. 1977年 -- Sa

14、nger 測序法,和同事Walter Gilbert分享了1980年的諾貝爾化學獎---人類和小鼠基因組測序過程中的主要技術,14. 1982年 -- 轉基因小鼠,,小鼠的歷史,2024/3/5,32,16. 1987-89年 -- 第一只基因敲除小鼠,Martin Evans，Oliver Smithies 和 Mario Capecch 領導的幾個研究小組--- 2001獲得了Lasker獎,17. 1996年 -- “百慕大法則”

15、,公共基因組序列數(shù)據(jù),18. 1998年 -- 克隆鼠,1997年克隆羊“多莉”誕生之后，夏威夷的一個小組培育出了第一批克隆鼠——“Cumulina”和她的姐妹們。,15. 1983年 -- PCR,Kary Mullis --1993年的諾貝爾獎,小鼠的歷史,2024/3/5,33,19. 1999年 -- 小鼠基因組測序協(xié)會,人類基因組三個主要測序中心（The Wellcome Trust Sanger Institute

16、, The Whitehead Center for Genome Research 和 Washington University Genome Sequencing Center）成立了一個相互協(xié)作的小鼠基因組測序機構，取名為小鼠基因組測序協(xié)會（Mouse Genome Sequencing Consortium ,MGSC),20. 2001年2月 -- 人類基因組,21. 2001年6月 -- 散彈法,美國公司Celera Ge

17、nomics 使用散彈法測得了用于銷售的小鼠序列草圖。散彈法是一種一次性測得基因組全序列的技術。,小鼠的歷史,2024/3/5,34,22. 2002年5月 -- 16號染色體與已被分析的人類 21號染色體序列高度相似,23. 2002年8月 -- 小鼠基因組物理圖譜,24. 2002年12月 -- 小鼠基因組,小鼠基因組測序協(xié)會發(fā)表了一份高質(zhì)量的小鼠基因組序列草圖，并且同時對C57BL/6J小鼠株系做了分

18、析。這個基因組大小約為2.5Gb，比人類基因組要小，預計的基因也少于30000個。約有40%的小鼠和人類基因組序列相高度似性，80%的人類基因在小鼠基因組中能找到相應的基因。同時還有不少文章對小鼠遺傳組成的其它方面做了詳細討論。在日本RIKEN 基因組科學實驗室的努力下，很多相關的重要資源都能夠被免費獲取。,小鼠的歷史,2024/3/5,35,轉基因小鼠技術的應用,基因表達調(diào)控、基因功能及發(fā)育調(diào)控作用的研究基因工程定向育種轉基因動物

19、生物反應器研制 人類疾病小鼠模型與基因治療藥理學研究器官移植環(huán)境科學研究,2024/3/5,36,基因表達調(diào)控、基因功能及發(fā)育調(diào)控作用的研究,Hox gene(同源異形盒基因）疾病基因學習與記憶基因生理周期基因,基因表達有時空與組織的特異性；外源基因的表達受特異性有關順式作用序列的調(diào)控；,2024/3/5,37,基因工程定向育種,向動物體轉移外源基因并使之在動物體內(nèi)表達，能夠克服物種間固有的生殖隔離，實現(xiàn)動物育種之間遺傳

20、物質(zhì)的交換。實質(zhì)是將基因轉移與傳統(tǒng)育種方法結合，各取其精華，快速創(chuàng)造新的目的變異和固定擴展變異，從而快速培育出高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)和抗逆動物品種。轉基因羊、豬、雞、魚、鼠等,2024/3/5,38,轉基因動物生物反應器研制,轉基因動物生物反應器概念： 將具某種重要應用價值的生物活性蛋白基因導入動物受精卵或早期胚胎，培育轉基因動物，使外源基因在動物的特定組織內(nèi)高效表達，再從這些組織的分泌液、浸出液或血清中分離提取目的基因產(chǎn)物。乳腺---理

21、想器官 腎臟和膀胱多肽藥物、蛋白質(zhì)疫苗、酶類,細菌-動物細胞-轉基因動物,2024/3/5,39,乳腺生物反應器具有以下特點：⑴乳腺是自我封閉系統(tǒng)，乳腺表達的蛋白質(zhì)不回流到血液循 環(huán)系統(tǒng)，避免外源基因表達的蛋白質(zhì)對動物本身的影響；⑵乳腺組織是一種有效的蛋白質(zhì)合成器；一頭奶牛一年可生產(chǎn)乳蛋白250—300Kg，一只綿羊或山羊一年可生產(chǎn)乳蛋白25—30Kg。如果有百分之一的乳蛋白代換成醫(yī)用蛋白，產(chǎn)量十分可觀。

22、⑶乳腺分泌的基因產(chǎn)物不但產(chǎn)量高，而且易提純。表達的蛋 白經(jīng)過充分的修飾加工，具有穩(wěn)定的生物活性。生物活性 接近天然產(chǎn)品；⑷在動物乳腺表達的外源基因可以遺傳，可用常規(guī)技術繁殖 生產(chǎn)群體。,轉基因動物生物反應器研制,2024/3/5,40,轉基因動物生物反應器研制,乳腺組織特異表的基因：具milk box保守序列 ----乳清蛋白基因----b乳球蛋白基因----酪蛋白基因已開發(fā)的產(chǎn)物：----

23、血栓治療藥物（組織型纖溶酶原激活因子) ----出血性疾?。蜃覸III，IX）----免疫治療藥物（IFN，IL，TNF）----營養(yǎng)制劑(人乳鐵蛋白）,2024/3/5,41,人類疾病小鼠模型與基因治療,癌癥---肺癌---p53功能缺陷遺傳病---地中海貧血（臨床失敗---細胞表達？）AD ---對AD患者死亡后腦部解剖發(fā)現(xiàn)腦部存積了一種β淀粉狀蛋白 ----將人類β淀粉狀蛋白的基因轉

24、到大鼠體內(nèi)使其發(fā)病， 再清除β淀粉狀蛋白，發(fā)現(xiàn)能夠減慢甚至停止病情,,2024/3/5,42,藥理學研究,胰島b細胞B7-1轉基因小鼠對STZ敏感阿霉素抗癌，但心臟毒性等副作用大---金屬硫蛋白MT具保護作用P糖蛋白---腫瘤多藥耐藥---knockout mice證實其影響藥物的分布與清除,2024/3/5,43,器官移植,超急性排斥反應補體激活的阻斷---免疫抑制劑危險補體活性調(diào)節(jié)因子的負

25、調(diào)控---膜輔助因子MCP---衰退促進因子hDAP/hCD591999---豬心—獼猴（器官大?。?2024/3/5,44,環(huán)境科學研究,生物可利用性的分析只能在活體研究毒理/環(huán)境基因組學轉基因線蟲---HSP16/lacZ,45,轉基因小鼠技術的主要問題,外源基因的整合率低外源基因的表達不理想成本高轉基因給動物造成插入突變和機能紊亂轉基因動物成活率低轉基因動物產(chǎn)品的安全性,改善外源基因轉移方法定點整合-