小鼠脊髓損傷后RhoA表達(dá)的時(shí)空變化.pdf

1、目前的研究結(jié)果表明，脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)后，在其損傷區(qū)域開始出現(xiàn)大量不同的軸突生長抑制物質(zhì)，這些生長抑制物質(zhì)大致可分為3類:髓磷脂相關(guān)抑制物(myelin-associated inhibitor，MAI)、膠質(zhì)瘢痕起源的抑制物（inhibitory components of the glial scar，ICGS）、斥性軸突導(dǎo)向分子(repulsiveaxon guidance molecules

2、，RGM)。據(jù)報(bào)道阻斷這些抑制因子將會提高SCI后神經(jīng)修復(fù)效果。越來越多的研究認(rèn)為，中樞神經(jīng)損傷后神經(jīng)元內(nèi)RhoA的表達(dá)及其活化是軸突再生能力低下的主要內(nèi)因，神經(jīng)損傷處微環(huán)境內(nèi)的大部分抑制劑分子可以刺激和激活神經(jīng)元內(nèi)的RhoA及進(jìn)一步激活其下游信號通路來抑制神經(jīng)軸突的生長。由此可見，RhoA在脊髓損傷病理學(xué)和再生修復(fù)中起著極其重要的作用。
　　 RhoA蛋白是一種小分子GTPase，屬于Ras超家族中的一員，能結(jié)合GDP（無活性

3、）或GTP（有活性），從而發(fā)揮其主要的分子開關(guān)作用，是所有真核細(xì)胞細(xì)胞骨架肌動蛋白的調(diào)節(jié)因子。在哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育階段，RhoA表達(dá)并參與調(diào)節(jié)神經(jīng)元的遷移和突起的伸長，而在成熟神經(jīng)元中幾乎不表達(dá)。當(dāng)神經(jīng)元損傷后，RhoA表達(dá)開始升高，并且能被激活。脊髓損傷后RhoA的重新高表達(dá)及其激活可致使軸突生長錐的塌陷。RhoA的高表達(dá)和激活還可以引起神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞凋亡。因此，設(shè)法降低受損神經(jīng)元的RhoA表達(dá)或抑制其激活就有可能為促進(jìn)脊髓損傷

4、修復(fù)提供一個新的治療策略。
　　 目前關(guān)于脊髓損傷后RhoA的表達(dá)變化已有過一些報(bào)道，但是存在不同的觀點(diǎn):大部分報(bào)道認(rèn)為損傷脊髓內(nèi)RhoA表達(dá)增加，但是也有人認(rèn)為脊髓損傷并不會改變RhoA的表達(dá)總量。另外，目前關(guān)于RhoA在損傷脊髓內(nèi)表達(dá)變化的研究主要只關(guān)注了SCI急性或亞急性期的變化情況。到目前為止，具體到RhoA在脊髓損傷后不同時(shí)間段、不同部位及不同細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)變化情況還不清楚。為了探明RhoA在損傷脊髓內(nèi)的時(shí)空表達(dá)變化情況

5、，本課題以成年小鼠全橫斷性脊髓損傷為動物模型，SCI術(shù)后存活1，3，7，14，28，56，112天后取材檢測了RhoA陽性細(xì)胞的分布;RhoA陽性反應(yīng)物在神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞及少突膠質(zhì)細(xì)胞的定位;各種類型細(xì)胞中RhoA陽性免疫反應(yīng)物的熒光強(qiáng)度的變化。為探討RhoA在脊髓損傷病理變化過程的機(jī)制以及今后以RhoA為靶向治療脊髓損傷提供基礎(chǔ)。
　　 1.材料與方法:
　　 1.1脊髓損傷模型的建立
　　 昆明小鼠64只

6、，雌性，12周齡，25～35g。實(shí)驗(yàn)動物被隨機(jī)分為假手術(shù)組和實(shí)驗(yàn)組:正常組(n＝8)，實(shí)驗(yàn)組:術(shù)后存活1天、3天、7天、14天、28天、56天和112天（每個時(shí)間點(diǎn)n=8）。
　　 昆明小鼠稱重后，用1％戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，劑量為30mg/kg。正常組在麻醉后于小鼠背側(cè)T10-11位置打開錐板，僅僅暴露脊髓。其他各組則需要在暴露同一位置脊髓后進(jìn)一步用顯微手術(shù)剪剪開硬脊膜，于T11位置垂直切除長度為1mm的一段脊髓，完全掏空損

7、傷腔。實(shí)驗(yàn)組分別在切除脊髓，查無出血后逐層縫合。常規(guī)護(hù)理，注射抗生素2周，每天早晚各一次排尿，持續(xù)1周。密切觀察小鼠的身體和精神狀態(tài)。
　　 1.2組織準(zhǔn)備和雙熒光免疫組織化學(xué)
　　 注射1％戊巴比妥鈉麻醉，劑量為50mg/kg，用4％多聚甲醛灌注取材，后固定于4℃的4％多聚甲醛過夜。然后移入30％蔗糖溶液中過夜，用OTC包埋后作冰凍切片，用CM1900恒溫箱冰凍切片機(jī)切片，切片方向分別為脊髓橫切和脊髓縱切。橫切組織取T

8、9節(jié)段和T10節(jié)段分別被連續(xù)切片，12μm厚。縱切組織取以損傷區(qū)為中心長約1.5厘米的脊髓組織，20μm厚，連續(xù)切片。最后將所有的切片貼在涂有明膠防脫的載玻片上，儲存在-20℃，以備進(jìn)一步使用。
　　 1.3免疫組化
　　 用抗體RhoA/NF200，RhoA/GFAP，RhoA/CNPase或RhoA/IBA1將組織切片行免疫組化雙染來檢測RhoA，以及RhoA陽性反應(yīng)物在神經(jīng)元、星形細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)

9、定位。為了闡明脊髓損傷后RhoA在不同的實(shí)質(zhì)細(xì)胞的時(shí)間和空間的詳細(xì)表達(dá)變化情況，我們先后對T10段和T9段橫截面的RhoA陽性細(xì)胞的總數(shù)，并對RhoA陽性細(xì)胞的在各種細(xì)胞中所占比例以及平均免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry，IHC)熒光強(qiáng)度進(jìn)行了定量分析。
　　 1.4圖像分析及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 免疫組化雙染所得的圖片分別用photoshop和Image-Pro Plus6.0圖片處理軟件進(jìn)行各類型的

10、RhoA陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)和熒光密度測定，將所得的數(shù)據(jù)使用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行單因素重復(fù)測量因素的方差分析、單樣本t檢驗(yàn)和單因素方差分析的方法進(jìn)行處理。
　　 2.結(jié)果:
　　 2.1探討脊髓損傷后RhoA表達(dá)變化情況
　　 正常的脊髓只有少數(shù)的神經(jīng)元或膠質(zhì)細(xì)胞微弱地表達(dá)RhoA。脊髓損傷后，RhoA表達(dá)上調(diào)顯著，特別是在損傷區(qū)附近。損傷后1天，RhoA陽性細(xì)胞主要分布在損傷區(qū)臨近的一個節(jié)段內(nèi)。損傷3天后，

11、RhoA陽性細(xì)胞數(shù)量顯著增加，在距離損傷區(qū)遠(yuǎn)達(dá)5個節(jié)段的脊髓組織內(nèi)均可見RhoA陽性細(xì)胞的分布。術(shù)后7天，RhoA陽性細(xì)胞的數(shù)量及其陽性強(qiáng)度均達(dá)到高峰，隨后RhoA陽性細(xì)胞的數(shù)量及其陽性強(qiáng)度逐漸降低。到術(shù)后112天，RhoA陽性細(xì)胞主要分布在損傷部位附近2個節(jié)段內(nèi)。通過熒光雙染，我們觀察到，部分RhoA陽性細(xì)胞可定位于神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞。定量計(jì)數(shù)結(jié)果顯示RhoA陽性細(xì)胞的數(shù)量從術(shù)后1天到術(shù)后7天一直在持續(xù)增加

12、，7天時(shí)達(dá)到高峰，然后逐漸減小，到術(shù)后達(dá)到了一個相當(dāng)?shù)偷乃健?br>　　 2.2 RhoA的表達(dá)定位
　　 2.2.1神經(jīng)元內(nèi)RhoA的表達(dá)情況
　　 在正常的脊髓中，通過RhoA/NF200雙熒光組織化學(xué)染色我們觀察到RhoA僅在個別神經(jīng)元內(nèi)中略微表達(dá)。術(shù)后1天，RhoA陽性神經(jīng)元的比例和熒光強(qiáng)度顯著提高，7天時(shí)達(dá)到頂峰。在T10節(jié)段，RhoA表達(dá)持久，甚至到術(shù)后112天時(shí)，表達(dá)量仍然較多，但T9節(jié)段水平在術(shù)后56

13、天時(shí)表達(dá)量幾乎與正常組相似，已經(jīng)沒有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。排除術(shù)后1天的RhoA陽性細(xì)胞百分比和術(shù)后112天的熒光強(qiáng)度值(p＞0.05)，術(shù)后同一時(shí)間點(diǎn)相比，T10節(jié)段均顯著高于T9(p＜0.05)。
　　 2.2.2膠質(zhì)細(xì)胞中RhoA的表達(dá)情況
　　 在正常的脊髓中，免疫組化結(jié)果顯示，只有很少的少突膠質(zhì)細(xì)胞可以檢測到非常弱的表達(dá)。但在脊髓受損后，各種膠質(zhì)細(xì)胞都有一定量的RhoA表達(dá)。星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元內(nèi)Rh

14、oA表達(dá)變化的趨勢大體一致。術(shù)后1天RhoA陽性細(xì)胞百分比和熒光強(qiáng)度均增加，7天時(shí)達(dá)到峰值，然后逐漸下降，并且在各節(jié)段內(nèi)各類細(xì)胞比例，沒有明顯的區(qū)別。然而，術(shù)后1天-56天期間內(nèi)，T10節(jié)段的熒光強(qiáng)度明顯高于T9節(jié)段(p＜0.05)。與此同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)RhoA陽性的小膠質(zhì)細(xì)胞與其它細(xì)胞的RhoA的表達(dá)量是不同的。術(shù)后1天，陽性細(xì)胞的百分比就已達(dá)到較高的水平，14天達(dá)到高峰，而熒光強(qiáng)度也達(dá)到最大。而后兩者比例和強(qiáng)度逐漸下降，但在112天時(shí)