銀屑病易感基因的克隆及其轉(zhuǎn)基因小鼠模型的構(gòu)建.pdf

1、[目的] 克隆銀屑病的易感基因HLA-Cw*0602，并制備攜帶該基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，以期獲得具有人類銀屑病樣病理變化特征且能穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因小鼠模型，為銀屑病發(fā)病機(jī)理的探索提供研究基礎(chǔ)，為治療銀屑病的藥物研究提供有效的動(dòng)物模型。 [方法] 收集銀屑病患者血液標(biāo)本，提取全血基因組DNA。用PCR-SSP方法篩選含有HLA-Cw*0602等位基因的陽性基因組DNA，并以之為模板，用PCR法擴(kuò)增人類HLA-Cw*060

2、2基因。將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆至pMD19-T載體上構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD19-T/HLA-Cw*0602并將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α擴(kuò)增培養(yǎng)。測(cè)序鑒定正確后，將該質(zhì)粒用Nde I單酶切或EcoR I、HindlII雙酶切處理，可獲得兩種不同類型的攜帶HLA-Cw*0602基因的注射用DNA片段。將所制備片段回收純化后稀釋至8ng/μl用于顯微注射。使用顯微注射儀將攜帶HLA-Cw*0602基因的DNA片段注入FVB小鼠受精卵原核內(nèi)，注射后挑選

3、形態(tài)完好的受精卵移植至假孕ICR雌鼠體內(nèi)繼續(xù)發(fā)育。小鼠出生后用PCR法篩選陽性轉(zhuǎn)基因小鼠。將陽性首建鼠與野生型小鼠進(jìn)行交配繁殖，建立新的小鼠品系，并用PCR方法篩選陽性子代鼠，為后續(xù)試驗(yàn)做準(zhǔn)備。 [結(jié)果] 從銀屑病人血液基因組標(biāo)本中成功篩選出攜帶人類銀屑病易感基因HLA-Cw*0602的樣本，并通過PCR技術(shù)擴(kuò)增得到包含了HLA-Cw*0602基因的天然啟動(dòng)子、所有內(nèi)含子、所有外顯子及下游polyA的基因片段。構(gòu)建了適合

4、顯微操作的攜帶HLA-Cw*0602基因的DNA片段，并將該片段以顯微注射法導(dǎo)入小鼠的受精卵原核內(nèi)。 本次試驗(yàn)共對(duì)500枚FVB小鼠受精卵進(jìn)行顯微注射，注射后挑選出320枚形態(tài)正常的卵細(xì)胞進(jìn)行移植。共移植至14只ICR代孕鼠體內(nèi)，其中10只分娩，共獲得新生小鼠59只。經(jīng)PCR篩選獲得陽性轉(zhuǎn)基因小鼠8只。攜帶銀屑病易感基因HLA-Cw*0602的轉(zhuǎn)基因小鼠模型初步構(gòu)建成功。 [結(jié)論] 從銀屑病患者的血液基因組標(biāo)本中