新激酶基因p93轉(zhuǎn)基因鼠模型的建立及功能初探.pdf

1、為了尋找和研究與心血管有關(guān)的重要功能基因及其表達(dá)模式，本室通過(guò)構(gòu)建正常成人心臟和主動(dòng)脈cDNA文庫(kù)，并在大規(guī)模分離篩選新的ESTs的基礎(chǔ)上，克隆到一個(gè)心肌特異性表達(dá)的新蛋白激酶TNNI3K。該基因定位在1號(hào)染色體短臂3區(qū)(1p21-31)，其cDNA全長(zhǎng)約3420bp，含一個(gè)2505bp的完整閱讀框，編碼835個(gè)氨基酸，此蛋白分子量約為93kD，故又命名為p93。結(jié)構(gòu)域組成分析表明p93含三種結(jié)構(gòu)域：N端為7個(gè)錨蛋白重復(fù)(ankyrin

2、repeats，ANK)結(jié)構(gòu)域，中間為一蛋白激酶(proteinkinase，PK)結(jié)構(gòu)域，C末端為富含絲氨酸(Ser-rich)結(jié)構(gòu)域；種系發(fā)生分析發(fā)現(xiàn)p93屬M(fèi)LK(mixedlineagekinase)家族成員。胎兒6種組織、成人8種組織的Northernblot結(jié)果和76種組織的多組織點(diǎn)陣膜雜交結(jié)果都證實(shí)p93基因僅在成人及胎兒心臟表達(dá)；免疫共沉淀結(jié)果表明，p93基因能與心肌收縮有關(guān)的心肌肌鈣蛋白I(cTnI)發(fā)生相互作用；細(xì)胞

3、學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示該基因在心肌細(xì)胞受損時(shí)可起一定的保護(hù)作用。 已有大量研究表明，染色體1p21-31是造成房室間隔缺損的大量基因集中存在的區(qū)域，而p93基因恰恰重疊落在此區(qū)域內(nèi)，提示p93基因與該疾病關(guān)系密切。根據(jù)已知的p93基因的功能提示，同時(shí)亦為今后深入探討p93基因與心臟疾病的關(guān)系，闡釋該基因在心臟生長(zhǎng)、發(fā)育中的作用及其組織特異性表達(dá)的意義。本課題進(jìn)行了如下研究：1.p93轉(zhuǎn)基因鼠模型的建立構(gòu)建心臟特異表達(dá)的α-MHC-p9

4、3真核表達(dá)載體，利用顯微注射法將其導(dǎo)入小鼠受精卵中，獲得p93轉(zhuǎn)基因首建鼠。 2.p93轉(zhuǎn)基因鼠的鑒定及功能初探應(yīng)用PCR、Southern印跡相結(jié)合的技術(shù)，鑒定p93基因在轉(zhuǎn)基因小鼠家系染色體上的整合及遺傳情況。并對(duì)全部轉(zhuǎn)基因鼠進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)：(1)逐一解剖心臟，觀察心腔內(nèi)各結(jié)構(gòu)；(2)摘眼球采血法取血，檢測(cè)血清：肌酸磷酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脫氫酶(LDH)和血Ca2+的濃度；(3)心臟稱重，計(jì)算心臟與體質(zhì)量比(mg

5、/g)。 實(shí)驗(yàn)獲得的主要結(jié)果如下：1.成功構(gòu)建了含有心臟特異表達(dá)的α-MHC啟動(dòng)子的p93基因真核表達(dá)載體。 2.建立并鑒定了p93基因在ICR品系小鼠中的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型。 3.p93轉(zhuǎn)基因鼠表型觀察：未見(jiàn)房室間隔缺損現(xiàn)象。 4.p93轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性鼠血Ca2+值較正常對(duì)照組升高，有顯著性差異(p＜0.05)；血清CK-MB值較正常對(duì)照組下降，有顯著性差異(p＜0.05)。 5.p93轉(zhuǎn)基因