新激酶基因p93轉(zhuǎn)基因鼠模型的建立及功能初探.pdf

1、為了尋找和研究與心血管有關(guān)的重要功能基因及其表達模式，本室通過構(gòu)建正常成人心臟和主動脈cDNA文庫，并在大規(guī)模分離篩選新的ESTs的基礎(chǔ)上，克隆到一個心肌特異性表達的新蛋白激酶TNNI3K。該基因定位在1號染色體短臂3區(qū)(1p21-31)，其cDNA全長約3420bp，含一個2505bp的完整閱讀框，編碼835個氨基酸，此蛋白分子量約為93kD，故又命名為p93。結(jié)構(gòu)域組成分析表明p93含三種結(jié)構(gòu)域：N端為7個錨蛋白重復(fù)(ankyrin

2、repeats，ANK)結(jié)構(gòu)域，中間為一蛋白激酶(proteinkinase，PK)結(jié)構(gòu)域，C末端為富含絲氨酸(Ser-rich)結(jié)構(gòu)域；種系發(fā)生分析發(fā)現(xiàn)p93屬MLK(mixedlineagekinase)家族成員。胎兒6種組織、成人8種組織的Northernblot結(jié)果和76種組織的多組織點陣膜雜交結(jié)果都證實p93基因僅在成人及胎兒心臟表達；免疫共沉淀結(jié)果表明，p93基因能與心肌收縮有關(guān)的心肌肌鈣蛋白I(cTnI)發(fā)生相互作用；細胞

3、學實驗結(jié)果顯示該基因在心肌細胞受損時可起一定的保護作用。 已有大量研究表明，染色體1p21-31是造成房室間隔缺損的大量基因集中存在的區(qū)域，而p93基因恰恰重疊落在此區(qū)域內(nèi)，提示p93基因與該疾病關(guān)系密切。根據(jù)已知的p93基因的功能提示，同時亦為今后深入探討p93基因與心臟疾病的關(guān)系，闡釋該基因在心臟生長、發(fā)育中的作用及其組織特異性表達的意義。本課題進行了如下研究：1.p93轉(zhuǎn)基因鼠模型的建立構(gòu)建心臟特異表達的α-MHC-p9

4、3真核表達載體，利用顯微注射法將其導(dǎo)入小鼠受精卵中，獲得p93轉(zhuǎn)基因首建鼠。 2.p93轉(zhuǎn)基因鼠的鑒定及功能初探應(yīng)用PCR、Southern印跡相結(jié)合的技術(shù)，鑒定p93基因在轉(zhuǎn)基因小鼠家系染色體上的整合及遺傳情況。并對全部轉(zhuǎn)基因鼠進行如下實驗：(1)逐一解剖心臟，觀察心腔內(nèi)各結(jié)構(gòu)；(2)摘眼球采血法取血，檢測血清：肌酸磷酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脫氫酶(LDH)和血Ca2+的濃度；(3)心臟稱重，計算心臟與體質(zhì)量比(mg

5、/g)。 實驗獲得的主要結(jié)果如下：1.成功構(gòu)建了含有心臟特異表達的α-MHC啟動子的p93基因真核表達載體。 2.建立并鑒定了p93基因在ICR品系小鼠中的轉(zhuǎn)基因動物模型。 3.p93轉(zhuǎn)基因鼠表型觀察：未見房室間隔缺損現(xiàn)象。 4.p93轉(zhuǎn)基因陽性鼠血Ca2+值較正常對照組升高，有顯著性差異(p＜0.05)；血清CK-MB值較正常對照組下降，有顯著性差異(p＜0.05)。 5.p93轉(zhuǎn)基因