心肌特異性激酶p93基因的血清水平測定及其功能初探.pdf

1、p93基因(GenBanka.c.為AF116826)是本室從成人心臟和主動脈cDNA文庫中通過大規(guī)模分離篩選新的ESTs(expressedsequencetags)克隆到的一個新基因。該基因定位在1p21-31(此區(qū)域與房室間隔缺損相關)，其cDNA全長約3420bp，含一個2505bp的完整閱讀框，編碼835個氨基酸，此蛋白分子量約為93kD，故命名為p93。結構域組成分析表明p93含三種結構域：N端為7個錨蛋白重復(ankyri

2、nrepeats，ANK)結構域，中間為一蛋白激酶(proteinkinase，PK)結構域，C末端為富含絲氨酸(Ser-rich)結構域；種系發(fā)生分析發(fā)現p93屬MLK(mixedlineagekinase)家族成員。胎兒6種組織、成人8種組織的Northernblot結果和76種組織的多組織點陣膜的雜交結果都證實p93基因僅在成人及胎兒心臟表達；心肌組織的免疫組織化學染色結果亦顯示p93僅在胎兒和成人心肌細胞內表達；體外激酶活性分析

3、結果證實p93可發(fā)生自身磷酸化。 大量前期研究表明，p93是一個新發(fā)現的心肌特異性表達的有功能的蛋白激酶，推測該基因與心臟發(fā)育和心肌病關系密切，但目前尚無直接的臨床證據證明p93與心血管疾病之間存在的緊密聯系；該基因的作用機制和激酶通路也不甚明了；也無恰當的動物模型來直觀、有效地闡明該基因在心臟發(fā)育中的作用及其機制。為解決上述問題，本課題分別在血清學水平、細胞學水平和整體水平對p93基因的功能進行了更深入的研究與探討：

4、1.p93血清水平的測定及其臨床意義首先建立了一個準確性高、可信度大、重復性好的ELISA實驗條件，在此基礎上檢測正常人、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、擴張性心肌病、風濕性心臟病和先天性心臟病患者的p93血清水平并比較其差異，結果顯示正常人和患者血清中均可檢測到P93抗原，說明正常和疾病狀態(tài)下均有P93分泌入血；冠心病等4種心血管疾病患者的p93血清水平均高于正常對照組；先心病組p93血清水平高于冠心病組。最后，得出如下結論：p93基因與冠

5、狀動脈粥樣硬化性心臟病、擴張性心肌病、風濕性心臟病和先天性心臟病密切相關，可能在上述各疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要作用。 2.p93基因的信號通路與在心肌細胞凋亡中的作用培養(yǎng)原代新生大鼠心室肌細胞，感染攜帶有p93、反義p93、p93突變體重組腺病毒和空載體腺病毒48h后，可見Ad-p93組損傷不明顯，而其它病毒感染組均有不同程度損傷。上述細胞經Hoechest染色顯示Ad-p93組只有輕度的染色質邊集，其它病毒感染組心肌細胞

6、均出現不同程度的細胞核的固縮、染色質邊集、核碎裂現象，有少量細胞出現典型的凋亡小體結構，說明p93基因具有抑制凋亡的作用。收集感染后細胞蛋白經WesternBlot檢測發(fā)現JNKs和p38磷酸化蛋白量是一致的，而Ad-p93組磷酸化ERKs蛋白量增高，表明p93基因過表達引起ERK通路磷酸化水平提高，其它通路磷酸化水平無明顯差異。故得出以下結論：p93基因可能對心肌細胞損傷具有保護作用；P93激酶的下游通路是ERK通路，其通過磷酸化ER

7、K通路來達到抑制凋亡、保護心肌細胞的作用。 3.利用雞胚模型初探p93基因在心臟發(fā)育過程中的作用首先，成功建立了一套成熟的雞胚培養(yǎng)條件和雞胚心臟顯微注射的技術平臺，為本課題組后期心臟發(fā)育的研究提供了一種簡便實用的技術手段。通過生物信息學分析，發(fā)現一個雞來源的、與人p93基因高度同源的預測基因，但是經反復WesternBlot實驗只檢測到一條與預測基因大小(190.7KD)不一致的蛋白條帶(約為80KD)，該條帶經質譜分析，結果顯