Dhtkd1基因點突變敲入小鼠模型的建立與表型初步分析.pdf

1、本研究分為二部分：
　　第一部分：Dhtkd1基因點突變敲入小鼠模型的建立及表達譜分析
　　腓骨肌萎縮癥(Charcot-Marie-Tooth disease，CMT)是一種最為常見的遺傳性周圍神經(jīng)病，具有很強的臨床和遺傳異質(zhì)性。課題組前期在對一個CMT2型大家系的基因定位研究中發(fā)現(xiàn)脫氫酶 E1和轉(zhuǎn)酮醇酶結(jié)構(gòu)域1(dehydrogenase E1 and transketolase domain containing1，D

2、HTKD1)基因發(fā)生無義突變[c.1455T>G(p.Tyr485*)]，由該基因突變所致的疾病已被命名為CMT2Q。本研究中針對Dhtkd1基因在小鼠體內(nèi)的表達進行了實時定量PCR檢測，發(fā)現(xiàn)Dhtkd1基因在成年C57BL/129品系小鼠體內(nèi)廣泛表達，且主要高表達于坐骨神經(jīng)、腎臟、肝臟中。其在坐骨神經(jīng)中的最高表達量提示其與周圍神經(jīng)系統(tǒng)關(guān)系密切。
　　為此，我們設(shè)計并構(gòu)建了含Dhtkd1 Tyr486*及neo標記的打靶載體，后將

3、測序正確的打靶載體轉(zhuǎn)入小鼠ES細胞，通過同源重組使突變片段替換ES細胞基因組片段。取G418藥物篩選得到的陽性克隆，經(jīng)囊胚注射獲得嵌合體小鼠，取嵌合率大于50％的嵌合小鼠與野生型小鼠交配得到雜合小鼠，之后雜合子小鼠間交配獲含突變的純合子小鼠，從而成功建立了Dhtkd1基因點突變敲入小鼠模型。此外，我們用半定量PCR的方法在RNA水平對Dhtkd1基因在三種基因型小鼠坐骨神經(jīng)和肝臟中的表達情況做了初步分析，發(fā)現(xiàn)突變雜合子小鼠、純合子小鼠皆

4、較野生型小鼠有明顯下調(diào)。總之，課題組期望通過建立Dhtkd1 Tyr486*敲入小鼠模型，更為精準地模擬自然狀態(tài)下的基因突變，在成體水平闡明DHTKD1基因突變導(dǎo)致CMT2Q的可能機制。
　　第二部分：Dhtkd1基因點突變敲入小鼠模型的表型初步分析
　　課題組在成功構(gòu)建Dhtkd1Tyr486*敲入小鼠模型的基礎(chǔ)上，通過對小鼠進行病理學、能量代謝和行為學檢測，以期發(fā)現(xiàn)類似CMT患者的表型，為DHTKD1基因突變導(dǎo)致CMT2

5、Q的體內(nèi)研究提供可靠模型。
　　采用雜合型ES細胞做Dhtkd1基因表達檢測，發(fā)現(xiàn)雜合型細胞與野生型細胞相比其表達水平顯著下降，隨后發(fā)現(xiàn)雖然雜合型細胞在 H2O2誘導(dǎo)下更易凋亡，且ATP產(chǎn)量明顯下降、NADP+/NADPH比值明顯上升。在對小鼠的表型分析中發(fā)現(xiàn)在雜合子交配所生后代中三種基因型比例接近1：2：1，并未出現(xiàn)胚胎致死。病理學分析中，對小鼠坐骨神經(jīng)組織半薄切片后進行H&E染色，未發(fā)現(xiàn)明顯病理學改變。能量代謝分析中，對小鼠肝

6、臟進行ATP、NADP+/NADPH的酶聯(lián)免疫分析發(fā)現(xiàn)純合子比雜合子及野生型ATP產(chǎn)量明顯下降，而雜合子與野生型之間無明顯差異；純合子及雜合子小鼠NADP+/NADPH較野生型小鼠皆有上調(diào)，且純合子更為顯著，說明Dhtkd1基因突變導(dǎo)致小鼠代謝能力下降且隨該基因表達量的下降而表現(xiàn)更嚴重。行為學檢測中，足爪熱痛實驗發(fā)現(xiàn)純合子較雜合子及野生型小鼠對痛覺的反應(yīng)明顯遲鈍。滾軸實驗發(fā)現(xiàn)野生型小鼠在轉(zhuǎn)軸上堅持運動的時間比雜合子和純合子小鼠久，提示突