Cchl1a3-R528H基因敲入小鼠低血鉀疾病模型的評(píng)估及其機(jī)制的探討.pdf

1、背景與目的：Cchl1a3基因(相當(dāng)于人類(lèi)CACNA1S基因)第528位精氨酸被組氨酸所替代（R528H）是與低鉀型周期性麻痹(Hypokalemic periodic paralysis,HypoPP)有關(guān)的錯(cuò)義突變，HypoPP是以肌無(wú)力或肌麻痹為表現(xiàn)的離子通道異常性疾病，以周期性發(fā)作為特征，目前其發(fā)病機(jī)制尚不十分明確。近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)部分HypoPP患者本身就攜帶突變基因，其主要涉及的與離子通道相關(guān)的突變基因除了CACNA1S基因

2、外，還有SCN4A基因和KCNE3基因，其中以CACNA1S-R528H基因最為常見(jiàn)。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)HypoPP的相關(guān)研究也僅局限于細(xì)胞水平及離子通道的電生理改變，對(duì)于相關(guān)突變是如何導(dǎo)致低血鉀及周期性麻痹的發(fā)生并未做出令人滿意的解釋。本課題組選擇人類(lèi)代表性突出的CaV1.1-R528H突變，應(yīng)用Red/ET技術(shù)和FLP/frt位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)在前期實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)成功的創(chuàng)建了Cchl1a3-R528H基因敲入小鼠模型。而本實(shí)驗(yàn)將對(duì)該模型能否作

3、為研究HypoPP疾病的動(dòng)物模型做出評(píng)估，并對(duì)其相關(guān)機(jī)制進(jìn)行探討，以期從整體動(dòng)物水平來(lái)探索HypoPP的發(fā)病機(jī)制，為臨床治療提供證據(jù)。
　　方法：1.檢測(cè)Cchl1a3-R528H基因敲入小鼠部分生化指標(biāo)：選擇20只野生型C57BL/6J小鼠(8周齡，雌雄各半)及20只Cchl1a3-R528H基因敲入小鼠(8周齡，雌雄各半)，檢測(cè)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶(AST)、葡萄糖(GLU)、血肌酐(Cr)、電解質(zhì)

4、(K+、Na+、Cl-)等指標(biāo)；
　　2.驗(yàn)證干化學(xué)法測(cè)定微量鼠尾血電解質(zhì)的可行性：使用干化學(xué)法檢測(cè)Cchl1a3-R528H基因敲入小鼠靜脈血及鼠尾血電解質(zhì)(K+、Na+、Cl-)，并與C57BL/6J小鼠進(jìn)行比較，計(jì)算電解質(zhì)分析儀的精密度及其相關(guān)性。
　　3.觀察腎上腺素對(duì)Cchl1a3-R528H基因敲入小鼠血鉀的影響：選擇野生型C57BL/6J小鼠及Cchl1a3-R528H基因敲入小鼠（雄性，8周齡，各32只），按

5、2×4析因設(shè)計(jì)方案進(jìn)行分組，分為8組（n=8）：正常對(duì)照組、正常低劑量組、正常中劑量組、正常高劑量組、突變對(duì)照組、突變低劑量組、突變中劑量組、突變高劑量組，分別注射生理鹽水、腎上腺素（200ug/kg、250ug/kg、300ug/kg）及U0126（MEK抑制劑），分別記錄注射前0min（基線值）和注射后10、20、30、40、50、60min時(shí)的血鉀值。
　　4.探討腎上腺素降低血鉀的相關(guān)機(jī)制：選擇野生型C57BL/6J小鼠及

6、Cchl1a3-R528H基因敲入小鼠（雄性，8周齡，各8只），按2×2析因設(shè)計(jì)方案進(jìn)行分組，分為4組（n=8）：對(duì)照組(正常對(duì)照)、u0126組、腎上腺素組(正常中劑量組)、u0126+腎上腺組，分別注射生理鹽水、腎上腺素及U0126（MEK抑制劑），血鉀記錄方法同上。
　　結(jié)果：1.野生型C57BL/6J小鼠組，雌雄小鼠之間生化指標(biāo)無(wú)差異（P＞0.05），Cchl1a3-R528H基因敲入小鼠組，雌雄小鼠之間生化指標(biāo)亦無(wú)差異（

7、P＞0.05），兩組間，同性別小鼠比較，也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），說(shuō)明該突變基因未對(duì)Cchl1a3-R528H基因敲入小鼠的生化性能產(chǎn)生影響，且野生型C57BL/6J小鼠可以成為后續(xù)實(shí)驗(yàn)良好的參照標(biāo)本。
　　2.干化學(xué)法測(cè)定靜脈血、鼠尾血電解質(zhì)和濕化學(xué)法測(cè)定靜脈血電解質(zhì)三項(xiàng)結(jié)果比較后，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），后兩者進(jìn)行相關(guān)性分析，得出Na+、K+、Cl-的相關(guān)系數(shù)分別為0.977、0.897、0.981，具有良好相

8、關(guān)性，證實(shí)了干化學(xué)法測(cè)定微量鼠尾血電解質(zhì)是可行的。
　　3.在相同處理因素前提下，突變因素對(duì)血鉀有顯著影響（P＜0.05），給藥因素對(duì)血鉀亦有顯著影響（P＜0.05），但突變與給藥的二級(jí)交互作用無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）：（1）野生型C57BL/6J小鼠組：與基線值相比，對(duì)照組血鉀無(wú)明顯變化（P＞0.05）；腎上腺素組血鉀下降（P＜0.05）；不同劑量腎上腺組之間相比，無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），無(wú)量-效關(guān)系；（2）Cch

9、l1a3-R528H基因敲入小鼠組：與基線值相比，對(duì)照組血鉀無(wú)明顯變化（P＞0.05）；腎上腺素組血鉀下降（P＜0.05）；不同劑量腎上腺組之間相比，無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），無(wú)量-效關(guān)系；（3）對(duì)兩組小鼠相同劑量腎上腺素組比較，Cchl1a3-R528H基因敲入小鼠血鉀降低幅度較野生型C57BL/6J小鼠顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。4.腎上腺素因素對(duì)血鉀有顯著影響（P＜0.05），抑制劑U0126因素對(duì)血鉀亦有顯著

10、影響（P＜0.05），但腎上腺與抑制劑U0126的二級(jí)交互作用無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）：（1）與基線值相比，對(duì)照組、U0126、U0126+腎上腺組血鉀無(wú)明顯變化（P＞0.05），且三組之間進(jìn)行比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；（2）腎上腺素組血鉀下降（P＜0.05）；且與對(duì)照組、U0126組、U0126+腎上腺組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　結(jié)論：1.建立了干化學(xué)法重復(fù)檢測(cè)微量鼠尾血電解質(zhì)的方法，解決了小