利用穩(wěn)定敲低細胞模型研究PLCγ1和PKCα在膠質瘤侵襲中的機制.pdf

1、神經(jīng)膠質瘤是最常見的顱內(nèi)惡性腫瘤之一，占顱內(nèi)腫瘤的40％～50％，治療方法以手術加放化療為主，但因其早期即呈侵潤性生長，故預后不盡理想，惡性膠質瘤如成膠質細胞瘤患者大多(77％)在確診后1年內(nèi)死亡。腫瘤的生長需要依靠血管系統(tǒng)來攝取營養(yǎng)和代謝廢物，腫瘤的侵襲和轉移首先表現(xiàn)在新生血管的形成，這個過程包括周圍基質的降解，血管內(nèi)皮細胞的遷移、增殖以及管型的形成，生長因子在這一過程中發(fā)揮重要作用，他們通過直接刺激內(nèi)皮細胞增殖，介導內(nèi)皮細胞表達血管

2、發(fā)生需要的關鍵酶或調節(jié)血管內(nèi)皮生長因子(VascularEndothelialGrowthFactor，VEGF)的表達而發(fā)揮作用。表皮生長因子受體(Epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR)通過參與細胞凋亡、增殖、分化作用來調節(jié)細胞生長和細胞侵襲能力，Joshua等研究證明接受表皮生長因子(Epidermalgrowthfactor，EGF)刺激后，神經(jīng)膠質瘤細胞內(nèi)及細胞間Ca2+濃度([Ca2+]i)增加

3、并可持續(xù)10min，前一作用可被磷脂酶C-γ1(PhospholipaseCgammal，PLCγ1)特異性抑制劑U-73122拮抗，說明神經(jīng)膠質瘤細胞內(nèi)[Ca2+]i的增加依賴PLCγ1信號通路，而細胞[C2+]i的波動與細胞遷移和增殖相關聯(lián)，細胞遷移和增殖與腫瘤侵潤和遠處轉移相關，這些間接說明PLCγ1信號通路可以影響腫瘤侵潤和遠處轉移。 PLCγ1受生長因子-受體復合物刺激發(fā)生酪氨酸磷酸化激活后，作為一種信號分子，在細胞生

4、長與分化的調控中發(fā)揮重要作用。在多種腫瘤中均有PLCγ1的高表達，且其高表達與腫瘤的進展程度有關。研究表明，在神經(jīng)膠質瘤細胞中PLCγ1可介導生長因子引發(fā)的腫瘤侵潤信號通路，作為細胞運動調節(jié)中一個重要的分子開關，PLCγ1在神經(jīng)膠質瘤的侵襲和轉移中發(fā)揮重要作用，但具體信號轉導方式還不十分清楚。 PLCγ1激活后水解磷脂酰肌醇4,5-二磷酸(phosphatidylinositol4,5-bisphosp-hate，PIP2)產(chǎn)生

5、兩種第二信使：肌醇1，4,5-三磷酸(inositol1，4,5-triphosphate，IP3)和甘油二酯(diacylglycerol，DAG)，誘導鈣離子釋放，繼而激活蛋白激酶C(proteinkinaseC，PKC)，從而起始下游一系列信號反應。PKC家族包含3大類，至少12種亞型，各種亞型在不同腫瘤組織及腫瘤的不同階段中的表達各不相同。其中，在多種腫瘤的發(fā)展及惡性表型維持中PKCa／β起重要作用。有研究顯示PKCa在膠質瘤細

6、胞中高表達，并介導膠質瘤的轉移與侵襲，但其具體機制不明。 在細胞靜息狀態(tài)下，核因子-κB(nuclearfactorkappaB，NF-κB)以無活性的潛在狀態(tài)存在于細胞漿中，并與NF-κB抑制劑IκB家族結合。當細胞受到NF-κB激活劑刺激時，與IκB家族分離，從細胞質易位至細胞核，與κB基序相結合，從而發(fā)揮轉錄調控作用。很多研究證實，不僅在免疫及炎癥反應中，NF-κB在腫瘤侵襲與轉移中亦發(fā)揮重要作用，NF-κB可以激活多種轉

7、錄因子，這些轉錄產(chǎn)物對促進和維持腫瘤惡性表型起重要作用。總之，NF-κB通過誘導多種基因的表達以促進細胞增殖，調節(jié)凋亡，促進血管生成，對于腫瘤的侵襲和轉移至關重要，但迄今為止，腫瘤細胞中NF-κB的激活機制仍未闡明。 我們以前的研究曾揭示，PLCγ1通過NF-κB介導結腸癌細胞系Lovo的運動和遷移。許多研究均發(fā)現(xiàn)，PKC家族中在細胞受到外界刺激時產(chǎn)生的NF-κB激活過程中起到關鍵作用。在B淋巴細胞中，BCR可通過PLCγ2-P

8、KC-CARMA1-NF-κB級聯(lián)介導其增殖和存活；而在內(nèi)皮細胞中，TRAFs-PLC-PI3K-PKC(PKCα和PKCζ)-ROS-NF-κB這一級聯(lián)介導炎癥反應。這些研究成果揭示了PLC、PKC和NF-κB之間可能存在的相互作用。 本研究以人神經(jīng)膠質瘤細胞株U-87MG為模型，利用細胞生物學和分子生物學及RNA干擾技術，研究了PLCγ1，PKCα和NF-κB在神經(jīng)膠質瘤中的關系，以期揭示人神經(jīng)膠質瘤侵襲和轉移的機制并尋找相

9、關信號通路中心調節(jié)物，為靶點新藥物研發(fā)提供細胞與分子生物學依據(jù)。 首先合成DNA分子(可轉錄出具有干擾作用的shRNA)，隨后退火DNA分子成雙連并將其連接至逆轉錄病毒載體pSUPER.retro，然后，利用脂質體將構建好的載體轉染至U-87MG內(nèi)，并用嘌呤霉素篩選穩(wěn)定敲低PLCγ1和PKCα的細胞系。應用蛋白質印跡(WesternBlot)實驗對細胞中PLCγ1和PKCα的蛋白表達水平進行分析，運用凝膠電泳遷移率改變分析(El

10、ectrophoreticMobilityShiftAssay，EMSA)揭示了PLCγ1、PKCα和NF-κB在神經(jīng)膠質瘤內(nèi)信號轉導的關系。 本實驗的主要結果和結論如下： 1.成功構建了人源PLCγ1siRNA和PKCαsiRNA真核表達的重組載體，所構建的載體雙酶切鑒定和DNA序列測定證明是正確的。然后重組體經(jīng)脂質體轉染U-87MG細胞并以嘌呤霉素篩選出了穩(wěn)定表達PLCγ1siRNA或PKCαsiRNA細胞系，分別命

11、名：U-87／pSUPER.retro／PLCγ1-shRNA-construct(簡稱U-87PLCγ1-)和U-87／pSUPER.retro／PKCα-shRNA-construct(簡稱U-87PKCα),經(jīng)WesternBlot分析顯示，與正常的U-87MG細胞和經(jīng)pSUPER.retro空載體轉染的U-87MG細胞相比，重組載體pSUPER.retro／PLCγ1-shRNA-construct和pSUPER.retro／P

12、KCα-shRNA-construct在蛋白水平上顯著地抑制了PLCγ1和PKCα的表達。結果表明本實驗成功構建了人源PLCγ1siRNA和PKCαsiRNA真核表達的重組載體，篩選出了穩(wěn)定敲低PLCγ1和PKCα表達的細胞系，從而為進一步研究PLCγ1及PKCα在神經(jīng)膠質瘤發(fā)生發(fā)展中所起的作用奠定了基礎。 2.人神經(jīng)膠質瘤細胞U-87MG高表達PKCα。本實驗采用WesternBlot，以小鼠胚胎成纖維細胞NIH3T3細胞為陽

13、性對照，驗證了人神經(jīng)膠質瘤細胞U-87MG細胞內(nèi)PKCα的表達情況，結果顯示PKCα在U-87MG細胞高表達。 3.在人神經(jīng)膠質瘤細胞U-87MG中EGF引發(fā)NF-κB核轉位的增加可能由PLCγ1介導。本實驗采用EMSA分析得到在生理情況下U-87MG細胞核內(nèi)少量存在NF-κB，受EGF刺激15min后NF-κB核轉位開始增加，到60min達最高峰，該過程在敲低PLCγ1表達的U-87MG細胞內(nèi)可被有效逆轉，結果提示：在U-87

14、MG細胞中EGF引起的NF-κB核轉位增加可能部分依賴于PLCγ1的介導。 4.在人神經(jīng)膠質瘤細胞U-87MG中PKCα可能介導NF-κB核轉位的增加。本實驗采用EMSA分析得到受PKC特異性激動劑(12-)十四酸佛波酯(-13-)乙酸鹽(phorbol12-myristate13-acetate，PMA)刺激15min后NF-κB核轉位開始增加，到60min達最高峰，該過程在敲低PKCα表達的U-87MG細胞內(nèi)可被部分逆轉，此