ADAM17在U87膠質(zhì)瘤干細胞遷移和侵襲中的運用及機制.pdf

1、惡性膠質(zhì)瘤(glioma)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最為常見的原發(fā)性腫瘤，在所有顱內(nèi)腫瘤中約占35.26％-60.96％，平均44.69％。盡管外科手術(shù)水平，放療、化療技術(shù)不斷提高，但并沒能顯著改善腦膠質(zhì)瘤患者的預后。膠質(zhì)母細胞瘤（WHOⅣ級膠質(zhì)瘤）患者平均生存期僅為14個月。腫瘤細胞高度侵襲性是膠質(zhì)瘤高死亡率的主要原因，同時也是膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展進程中重要的生物學標志，與膠質(zhì)瘤患者的預后密切相關(guān)。圍繞著腫瘤侵襲機制的研究一直以來是膠質(zhì)瘤研究的重點。

2、
　　 腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移是多基因、多步驟相互作用的過程，主要包括惡性腫瘤細胞從原發(fā)灶遷移粘附到細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)、降解并穿過ECM和基膜、通過血管進入宿主微環(huán)境等步驟。目前觀點認為，細胞外基質(zhì)降解酶系統(tǒng)如基質(zhì)金屬蛋白酶家族(Matrixmetalloproteinases，MMps)和去整合素-金屬蛋白酶家族(a disintegrin and metalloproteases，ADAM

3、s)等參與了腫瘤侵襲過程。ADAM17又稱為腫瘤壞死因子a前體轉(zhuǎn)換酶(Tumor necrosis factor-alphaConverting Enzyme，TACE)，是去整合素-金屬蛋白酶(a disintegrin andmetalloproteinase，ADAMs)家族重要成員之一。由于具有水解細胞膜上的腫瘤壞死因子，同時能酶解活化多種表皮生長因子受體(EGFR)的配體，激活EGFR相關(guān)信號通道，與腫瘤的侵襲密切相關(guān)。ADA

4、M17在腫瘤侵襲機制中的作用研究日益成為研究的熱點。
　　 近來發(fā)現(xiàn)ADAM17在多種腫瘤組織中高表達，包括非小細胞肺癌，乳腺癌，卵巢癌，腎癌，前列腺和胰腺癌等。研究表明ADAM17同樣在人膠質(zhì)瘤細胞中高表達，與膠質(zhì)瘤的惡性進展密切相關(guān)。Zheng等構(gòu)建針對ADAM17的ShRNA表達載體轉(zhuǎn)染處理人膠質(zhì)瘤U87細胞，揭示ADAM17 shRNA干擾后U87細胞增殖，粘附和侵襲能力降低，凋亡增加。絕大部分膠質(zhì)瘤屬于實體性腫瘤。實體

5、性腫瘤細胞的侵襲是一個涉及基底膜與細胞外基質(zhì)降解;腫瘤細胞增殖、粘附、遷移;腫瘤血管內(nèi)皮細胞增殖、血管生成;腫瘤細胞通過血管轉(zhuǎn)移的復雜過程。結(jié)合ADAM17自身的結(jié)構(gòu)特點，酶裂解的生物學功能及其活化胞內(nèi)多條信號通路的特性，推斷ADAM17在膠質(zhì)瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要的生物學作用:其一，ADAM17能降解細胞外基質(zhì)中的Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ型膠原、明膠和彈性纖維（構(gòu)成基底膜的主要成分），使細胞間質(zhì)的空隙增大，為腫瘤血管的形成提供有利的空間，參與膠

6、質(zhì)瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移;其二，ADAM17還可以增強促血管生成因子的作用，與多種血管生成相關(guān)因子的表達或分泌密切相關(guān)，包括血管內(nèi)皮生長因子及受體(VEGF/VEGFR)、缺氧誘導因子(HIF)、成纖維生長因子(bFGF)、趨化因子（chemokines）、表皮生長因子及受體(EGF/EGFR)、白細胞介素(IL)等，直接或間接參與腫瘤血管生成、促進腫瘤遷移和侵襲。其三，ADAM17可以剪切脫落和活化腫瘤壞死因子a(TNF-α)、轉(zhuǎn)化生長因子(

7、TGF-α)，白介素6(IL-6)、雙調(diào)蛋白(AR)等多種表皮生長因子受體(EGFR)的配體，激活EGFR相關(guān)通道。由酪氨酸蛋白激酶活化引起的級聯(lián)反應，激活P13K/AKT、MEK/ERK等多條信號通路，最終影響腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲。ADAM17通過激活EGFR及其下游相關(guān)信號通路在介導腫瘤侵襲中發(fā)揮至關(guān)重要作用，因此研究ADAM17和所調(diào)控EGFR相關(guān)信號通路（（PI3K/AKT和MEK/ERK通路）在膠質(zhì)瘤中的表達情況和對膠質(zhì)

8、瘤遷移和侵襲的調(diào)控機制，尤其是始動環(huán)節(jié)的介導作用，對于進一步了解ADAM17的功能、作用機制及膠質(zhì)瘤侵襲性機制有著重要的意義。
　　 腫瘤干細胞(cancer stem cells，CSCs)理論的提出深化了人們對于惡性膠質(zhì)瘤起源的認識，也為研究腫瘤侵襲性的調(diào)控機制，尤其是始動環(huán)節(jié)的介導作用等問題提供了新思路。越來越多的證據(jù)表明，在腫瘤內(nèi)部存在著一組具有干細胞特性的小的細胞集群一腫瘤干細胞(cancer stem cells，C

9、SCs)或稱腫瘤始動細胞(tumorinitiating cells)。膠質(zhì)瘤CSCs即膠質(zhì)瘤干細胞(glioma stem cells，GSCs)表達細胞表面抗原CD133和神經(jīng)巢蛋白(nestin)，并具有自我更新、多向分化以及體內(nèi)成瘤的能力，可以分化成多種子代細胞成分，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，并且與腫瘤的化療耐藥性及放療抗性密切相關(guān)，因此在膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展進程中發(fā)揮了決定性作用，被認為可能是膠質(zhì)瘤發(fā)生、侵襲轉(zhuǎn)移、治療抵抗以及復發(fā)的

10、根源。然而，這群GSCs在膠質(zhì)瘤侵襲中所扮演的角色尚不清楚:它們是否始動或參與了膠質(zhì)瘤侵襲過程？其分子機制如何？新近我們發(fā)現(xiàn)，GSCs高表達ADAM17，具體生物學功能意義不清?？紤]到ADAM17在EGFR相關(guān)信號通路激活起“起始開關(guān)”，與腫瘤遷移和侵襲密切相關(guān)。我們推測，GSCs高表達的ADAM17能夠通過活化EGFR及下游相關(guān)信號通路(PI3K/AKT和MEK/ERK)，促進膠質(zhì)瘤遷移和侵襲。
　　 本研究中，我們首先觀測在

11、不同病理級別膠質(zhì)瘤組織中ADAM17表達情況及臨床意義，明確ADAM17表達與膠質(zhì)瘤病理級別成正相關(guān)，有望成為抗膠質(zhì)瘤治療新的靶點;然后，我們檢測了GSCs標志物CD133在膠質(zhì)瘤細胞系U87的表達，并從中成功分離、培養(yǎng)和鑒定出GSCs;研究了ADAM17在GSCs中的表達及ADAM17基因敲除或化學增強劑活化后對膠質(zhì)瘤干細胞遷移和侵襲的影響;最后，我們探討了EGFR相關(guān)信號通路（PI3K/AKT和MEK/ERK）在ADAM17調(diào)控GS

12、Cs介導的腫瘤遷移和侵襲中的作用機制，證實ADAM17可能通過調(diào)控EGFR及其下游PI3K/AKT信號通路影響GSCs遷移和侵襲。
　　 第一部分ADAM17在不同惡性程度膠質(zhì)瘤組織中的表達及臨床意義
　　 目的：探討ADAM17在不同惡性程度膠質(zhì)瘤組織中的表達情況及其與患者預后的關(guān)系。
　　 方法收集103例手術(shù)切除的膠質(zhì)瘤組織及14例癲癇顳葉切除的相對正常腦組織，應用熒光定量PCR、免疫組化染色等方法檢測組織

13、標本中ADAM17基因、蛋白的表達情況，并與膠質(zhì)瘤的惡性程度進行Spearman相關(guān)分析;利用預后生存分析探討膠質(zhì)瘤組織中ADAM17的表達水平與患者預后的關(guān)系。
　　 結(jié)果膠質(zhì)瘤組織的ADAM17表達高于正常腦組織(P＜0.01)，與膠質(zhì)瘤的病理級別呈正相關(guān)(r=0.76);預后生存分析顯示高級別膠質(zhì)瘤患者ADAM17高表達預示著較短的生存時間;Cox回歸多因素分析顯示ADAM17是膠質(zhì)瘤患者獨立的預后危險因素。
　　

14、 結(jié)論檢測膠質(zhì)瘤組織中ADAM17的表達水平有助于評價膠質(zhì)瘤的生物學行為和患者的預后，具有臨床研究價值。
　　 第二部分人惡性膠質(zhì)瘤細胞系U87中分選、培養(yǎng)和鑒定膠質(zhì)瘤干細胞
　　 目的：從人惡性膠質(zhì)瘤細胞系U87中分選、培養(yǎng)和鑒定膠質(zhì)瘤干細胞，為研究膠質(zhì)瘤干細胞侵襲性奠定基礎(chǔ)。
　　 方法選擇人惡性膠質(zhì)瘤細胞系U87，利用流式細胞儀分選出CD133+的細胞。通過無血清培養(yǎng)基（DMEM/F12+20ng/mL b

15、FGF+20ng/mL EGF+100μl B27）培養(yǎng)獲得呈懸浮生長的U87腫瘤干細胞球;利用免疫熒光、western-blot對U87腫瘤干細胞球形態(tài)、自我更新能力、免疫表型、多向分化能力進行鑒定。
　　 結(jié)果 CD133+U87膠質(zhì)瘤細胞能夠在無血清培養(yǎng)基中呈克隆球樣懸浮生長，并且能夠傳代增殖。經(jīng)免疫熒光染色及流式細胞儀檢測，腫瘤球細胞高表達干細胞標志CD133和Nestin。將腫瘤球在含血清培養(yǎng)基中進行誘導分化，表現(xiàn)多向

16、分化潛能，產(chǎn)生表達星形膠質(zhì)細胞(GFAP)、神經(jīng)元(β-tubulinⅢ)和少突膠質(zhì)細胞(GAlC)的子代腫瘤細胞。
　　 結(jié)論人惡性膠質(zhì)瘤細胞系U87中存在著一組具有干細胞特性的小的細胞集群(GSCs)，利用流式細胞儀分選和無血清培養(yǎng)劑能有效的分離和擴增U87細胞系中的膠質(zhì)瘤干細胞。
　　 第三部分ADAM17通過調(diào)控EGFR信號通路影響膠質(zhì)瘤干細胞遷移和侵襲
　　 目的：研究ADAM17對膠質(zhì)瘤干細胞(GSC

17、s)遷移和侵襲的影響，并探索EGFR相關(guān)信號通路(PI3K/AKT和MEK/ERK)在ADAM17調(diào)控GSCs介導的腫瘤遷移和侵襲中的作用機制。
　　 方法分別采用免疫熒光及Western-blot檢測GSCs中ADAM17蛋白的表達;利用RNA干擾(ShRNA)技術(shù)阻滯或ADAM17特異性增強劑(PMA)強化ADAM17mRNA及蛋白表達，Transwell小室實驗檢測各干預組GSCs遷移和侵襲性的變化;同時利用Western

18、 blot檢測檢測ADAM17、EGFR/p-EGFR、AKT/p-AKT、ERK/p-ERK的蛋白表達變化。用SPSS13.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)果相對于CD133-細胞，GSCs高表達ADAM17，ADAM17 ShRNA能有效抑制GSCs的遷移和侵襲，反之ADAM17特異性增強劑(PMA)能增強GSCs的遷移和侵襲（P＜0.05或P＜0.01）。AD