TALENs介導(dǎo)的山羊BLG基因敲除和hLF基因敲入的研究.pdf

1、TALENs技術(shù)是最近幾年來(lái)迅速發(fā)展起來(lái)的基因靶向修飾技術(shù)，該技術(shù)能夠簡(jiǎn)單、高效的在目標(biāo)靶基因位點(diǎn)處產(chǎn)生多種突變效應(yīng)，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于各種動(dòng)植物細(xì)胞及個(gè)體的基因修飾研究中。與經(jīng)典的基因打靶技術(shù)相比，TALEN核酸酶在與基因打靶載體的共同作用下，具有“一步法”完成目標(biāo)基因的敲除和外源基因定點(diǎn)敲入的優(yōu)勢(shì)。本研究通過(guò)利用TALENs基因編輯技術(shù)和hLF基因打靶載體在山羊BLG基因第一外顯子起始密碼子附近敲除目標(biāo)靶序列，并在敲除位點(diǎn)引入人乳鐵蛋

2、白基因，從而降低山羊乳汁中對(duì)人具有致敏作用的β-乳球蛋白的含量，提高羊奶的營(yíng)養(yǎng)和消費(fèi)價(jià)值。
　　本研究的目的是應(yīng)用TALENs技術(shù)與山羊β-乳球蛋白調(diào)控序列，PCR擴(kuò)增獲得的hLF cDNA基因序列，人巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)/增強(qiáng)子(Pcmv)和SV40 poly A以及HSV-TK的負(fù)篩選基因等元件，構(gòu)建含新霉素抗性篩選基因(Neo)的乳腺特異性表達(dá)hLF的基因打靶載體。用構(gòu)建獲得的TALENs和乳腺特異性打靶載體轉(zhuǎn)染山羊胎兒成纖維細(xì)胞

3、，篩選獲得轉(zhuǎn)基因單克隆細(xì)胞株，并通過(guò)體細(xì)胞核移植技術(shù)制備在BLG基因上定點(diǎn)敲入hLF的轉(zhuǎn)基因山羊。移植受體并通過(guò)懷孕出生的轉(zhuǎn)基因山羊，用來(lái)培育新一代高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)不含對(duì)人致敏的，并富含對(duì)人體有益的人乳鐵蛋白轉(zhuǎn)基因乳用奶山羊新品系。
　　山羊β-乳球蛋白基因(BLG)位于11號(hào)染色體，全長(zhǎng)8088bp，編碼BLG的轉(zhuǎn)錄單元長(zhǎng)4698bp，5'端非翻譯區(qū)2148bp，3'端非翻譯區(qū)1242bp，含有七個(gè)外顯子，六個(gè)內(nèi)含子。本研究設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，按

4、照已有報(bào)道的TALENs設(shè)計(jì)原則，以山羊BLG基因序列為模板設(shè)計(jì)TALENs，在第一外顯子ATG-2189起始密碼子附近選取2條靶序列，作為指導(dǎo)構(gòu)建TALENs表達(dá)載體的靶向識(shí)別序列。選取與靶序列相對(duì)應(yīng)的識(shí)別雙殘基模塊和骨架載體，經(jīng)過(guò)連接、轉(zhuǎn)化、篩選、鑒定，最終獲得2對(duì)TALEN表達(dá)載體(TALEN-L12/TALEN-R12、TALEN-L18/TALEN-R18)，TALENs表達(dá)載體的構(gòu)建為TALENs活性鑒定及BLG基因定點(diǎn)修飾

5、的研究奠定基礎(chǔ)。
　　為了獲得能夠在山羊乳腺中特異性高效表達(dá)人乳鐵蛋白的載體，本研究以山羊BLG基因?yàn)槟０?，PCR分別擴(kuò)增出山羊5'調(diào)控序列1035 bp和3'調(diào)控序列1826bp，再以本實(shí)驗(yàn)室保存的BLC14為基礎(chǔ)，載體包括5'調(diào)控序列、CMV啟動(dòng)/增強(qiáng)子、hLF cDNA基因序列、SV40polyA啟動(dòng)/增強(qiáng)子、Neo基因和3'調(diào)控序列，并通過(guò)PCR擴(kuò)增的方法獲得其功能基因序列，然后連接上述BLG調(diào)控序列，鑒定插入序列的正反向

6、，挑取正確的載體。在確定正確的乳腺特異性基因表達(dá)載體之后，通過(guò)酶切線性化，再與實(shí)驗(yàn)室保存的含有一個(gè)HSV-TK的負(fù)篩選基因序列相連接，從而獲得本實(shí)驗(yàn)需要的乳腺特異性表達(dá)hLF的基因打靶載體，并命名為BLTF-7-82。
　　基因打靶載體BLTF-7-82與TALEN-18L/18R質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染30日齡原代山羊胎兒成纖維細(xì)胞，細(xì)胞轉(zhuǎn)染三天后通過(guò)藥物對(duì)進(jìn)行篩選。所用藥物濃度為G418(800μg/mL)和GCV(10μg/mL)，正負(fù)篩

7、選維持7-14天，挑取細(xì)胞6孔板上生長(zhǎng)狀況良好的細(xì)胞克隆株，傳代到24孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，此時(shí)藥物正負(fù)篩選的濃度降低一半，最終獲得藥物抗性胎兒成纖維細(xì)胞125株。將篩選獲得的陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行消化，并應(yīng)用特異性引物進(jìn)行整合情況的檢測(cè)。首先用引物cmv-1/cmv-2對(duì)人乳鐵蛋白和CMV基因進(jìn)行整合檢測(cè)，PCR產(chǎn)物大小為775bp，能擴(kuò)增出目的條帶的樣品則為整合hLF的陽(yáng)性細(xì)胞株，獲得整合細(xì)胞株89株。之后將整合hLF的陽(yáng)性細(xì)胞株的單克隆細(xì)胞株基因

8、組，再分別用引物5farcmv-1/5far cmv-2和neo3far-1/neo3far-2對(duì)其進(jìn)行定點(diǎn)整合檢測(cè)，PCR產(chǎn)物大小分別為1703 bp和3604bp，同時(shí)擴(kuò)增出上述兩個(gè)條帶，才能確定為在BLG基因上定點(diǎn)整合人乳鐵蛋白外源基因的陽(yáng)性細(xì)胞株，根據(jù)PCR檢測(cè)與序列比對(duì)結(jié)果最終確定1株細(xì)胞為定點(diǎn)整合hLF外源基因的陽(yáng)性細(xì)胞株，其基因打靶效率約為1.5×10-6。
　　同源重組檢測(cè)顯示該細(xì)胞株為在山羊BLG基因座上雙等位定