SIRT1基因敲入小鼠通過激活FOXO3a及抑制mTOR信號通路提高卵巢儲備及延長卵巢壽命.pdf

1、目的：
　　能量限制(caloric restriction,CR)在生物體的健康與壽命延長中所起的重要作用已被廣泛認(rèn)可，近年的研究表明CR也能延長哺乳動物卵巢的壽命。我們的前期研究發(fā)現(xiàn), SIRT1可能在能量限制介導(dǎo)的提高卵巢卵泡儲備、延長卵巢壽命的機(jī)制中起著關(guān)鍵的調(diào)控作用。但其調(diào)控機(jī)制尚未清楚。本研究通過建立SIRT1基因敲入小鼠的模型，使得SIRT1在卵母細(xì)胞中特異性持續(xù)高表達(dá)，觀察比較SIRT1基因敲入小鼠與野生型小鼠在卵

2、泡發(fā)育和卵巢壽命、SIRT1、FOXO3a及mTOR蛋白表達(dá)等方面的差異，旨在研究SIRT1基因敲入小鼠是否可以提高卵巢儲備及延長卵巢壽命，以及SIRT1通過何種信號通路影響卵巢儲備及卵巢壽命。
　　方法：
　　在體內(nèi)介導(dǎo)Rosa26基因座LoxP位點(diǎn)插入SIRT1的基因片段，利用Cre重組酶組織表達(dá)的特異性從而獲得卵巢卵母細(xì)胞特異性持續(xù)高表達(dá)SIRT1的基因敲入小鼠，并篩選出純合子高表達(dá)小鼠、雜合子高表達(dá)小鼠及陰性對照的小

3、鼠，與同齡C57BL/6野生型小鼠對比。觀察小鼠的陰道開口時間及首次出現(xiàn)動情的時間，部分小鼠至成年（35天）時，分4組（野生型組、陰性對照組、雜合子高表達(dá)組、純合子高表達(dá)組），每組分別6只小鼠，麻醉后頸椎脫臼處死小鼠，取小鼠雙側(cè)卵巢，固定后石蠟包埋備用。剩余部分小鼠同樣分4組（野生型組、陰性對照組、雜合子高表達(dá)組、純合子高表達(dá)組），每組分別6只小鼠，進(jìn)行生殖能力實(shí)驗(yàn)，分別記錄每只小鼠每胎的產(chǎn)仔數(shù)量及產(chǎn)仔年齡，小鼠至老年（15月齡）時，麻

4、醉后頸椎脫臼處死小鼠，取小鼠雙側(cè)卵巢，固定后石蠟包埋備用。以上35天齡成年小鼠及15月齡老年小鼠蠟塊切片后，進(jìn)行蘇木素-伊紅（hematoxylin and eosin，HE）染色觀察，并選取7張有代表性的組織切片，計數(shù)各級卵泡數(shù)以及各級卵泡數(shù)占卵泡總數(shù)的比例。同時每只小鼠的SIRT1、FOXO3a、mTOR各個因子各取1張卵巢切片行免疫組化，檢測SIRT1、FOXO3a、mTOR的蛋白表達(dá)定位情況以及進(jìn)行免疫組化EI（extent a

5、nd intensity）評分半定量分析比較各組間蛋白表達(dá)的強(qiáng)弱情況。
　　結(jié)果：
　　陰道開口及動情周期:與野生型小鼠相比，轉(zhuǎn)基因小鼠的陰道開口時間及第一次出現(xiàn)動情周期天齡延遲（29.16?0.65day vs26.14?0.62day,P<0.05；32.85?0.55day vs31.66?1.14day,P<0.05）。生殖能力：雖然第一胎產(chǎn)仔月齡及第一胎產(chǎn)仔數(shù)在轉(zhuǎn)基因小鼠及野生型小鼠間沒有差異（4.55?0.33

6、month vs5.46?0.45 month, P>0.05；7.07?0.48 vs7.80?0.35, P>0.05），但轉(zhuǎn)基因小鼠的末胎產(chǎn)仔月齡大于野生型小鼠（10.20?0.93month vs7.16?0.65month，P<0.05），轉(zhuǎn)基因小鼠的末胎產(chǎn)仔數(shù)高于野生型小鼠(7.20?0.16 vs6.64?0.19， P<0.05）,轉(zhuǎn)基因小鼠的總胎次多于野生型小鼠的總胎次（2.40?0.12times vs1.530.0

7、9times， P<0.05），轉(zhuǎn)基因小鼠的總產(chǎn)仔數(shù)高于野生型小鼠（16.40?0.27 vs13.38?0.15,P<0.05）。卵泡計數(shù)：HE染色結(jié)果顯示，35天齡成年鼠純合子高表達(dá)組或雜合子高表達(dá)組的健康卵泡數(shù)的均數(shù)及比例均顯著高于野生型或陰性對照組(474.70?57.00 or383.88?52.15 vs264.75?28.72 or223.88?28.79,P?0.05;80.76％?2.68%or77.69%?2.74%

8、vs62.80%3.18%or60.68%4.60%,P<0.05)，而純合子高表達(dá)組或雜合子高表達(dá)組的閉鎖卵泡數(shù)則低于野生型組或陰性對照組(111.00?1.57 or105.75?7.31 vs154.00?9.10 or143.25?2.05, P?0.05；19.23%?2.6%or22.3%?2.7%vs37.2%?3.9%39.3%?4.5%,P<0.05).35天齡成年鼠的純合子高表達(dá)組或雜合子高表達(dá)組的原始卵泡的均數(shù)及比

9、例均顯著高于野生型或陰性對照組(264.75?34.58 or205.00?48.34 vs88.75?13.34 or78.75?19.61, P?0.05;40.8%?0.04% or40.5%?6.9%vs20.9%?2.2%or20.8%?0.04%,P<0.05)。同樣的，15月齡老年鼠純合子高表達(dá)組或雜合子高表達(dá)組的健康卵泡均數(shù)及比例均顯著高于野生型組或陰性對照組(28.50?4.68 or36.40?5.05 vs11.0

10、0?3.59 or10.33?2.72, P?0.05;75.1%?4.8%or76.3%?3.4%vs30.7%?8.9%or43.8%?11.4%,P?0.05)，而純合子高表達(dá)組或雜合子高表達(dá)組的閉鎖卵泡均數(shù)及比例均低于野生型組（9.00?1.95 or11.00?1.92 vs20.50?4.46, P?0.05；24.9%?4.8%or23.7%?3.4%vs69.3%?8.9%，P?0.05）。15月齡的純合子高表達(dá)組或雜合

11、子高表達(dá)組的原始卵泡均數(shù)及比例均高于野生型或陰性對照組（1.83?1.28 or1.60?0.81 vs0.33?0.21 or0.33?0.21, P?0.05;4.1%?2.8%or2.8%1.4%vs0.7%?0.5%or1.0%?0.7%,P?0.05）。蛋白表達(dá)：免疫組化結(jié)果提示，35天成年鼠及15月齡老年鼠SIRT1,FOXO3a,mTOR均表達(dá)于健康的卵泡，閉鎖卵泡不表達(dá)。SIRT1主要表達(dá)在卵母細(xì)胞核及細(xì)胞漿，顆粒細(xì)胞表

12、達(dá)極弱或者不表達(dá)。FOXO3a在原始卵泡中主要表達(dá)于卵母細(xì)胞核及細(xì)胞漿，在發(fā)育卵泡（初級卵泡、次級卵泡、竇狀卵泡）中主要表達(dá)于細(xì)胞漿。mTOR主要表達(dá)于卵母細(xì)胞核及卵母細(xì)胞漿，顆粒細(xì)胞表達(dá)極弱或者不表達(dá)。同時，免疫組化半定量檢測EI評分結(jié)果提示，35天齡純合子高表達(dá)組或雜合子高表達(dá)組小鼠的SIRT1表達(dá)高于野生型小鼠或陰性對照組小鼠（7.40?1.02 or5.63?0.91 vs2.20?0.58 or2.00?0.54,P<0.05

13、）；15月齡純合子高表達(dá)組或雜合子高表達(dá)組小鼠的SIRT1表達(dá)高于野生型組或陰性對照組小鼠（3.71?1.10 or2.00?1.16 vs0.80?0.48 or1.40?1.09,P<0.05）。35天齡純合子高表達(dá)組或雜合子高表達(dá)組小鼠的FOXO3a的表達(dá)高于野生型組或陰性對照組（4.8?0.80 or3.13?0.58 vs1.60?0.24 or1.60?0.24， P<0.05）。15月齡純合子高表達(dá)組或雜合子高表達(dá)組小鼠的