Foxo3a通過Bim轉錄促進NAFLD中Kupffer細胞自噬及抑制炎癥小體激活的機制研究.pdf

1、目的：肝臟內過多的脂質沉積可阻斷Kupffer細胞（Kupffer cells,KCs）的自噬流，導致炎癥小體的激活，從而加重肝臟內脂質沉積導致的炎癥反應。叉頭蛋白O3a(forkhead box protein O3a, Foxo3a）是連接炎癥反應和能量代謝的重要轉錄因子。但是，在高脂飲食（high fat diet,HFD）的條件下，Foxo3a調節(jié)KCs自噬并抑制炎癥小體激活的機制尚不清楚。因此，本實驗將研究非酒精性脂肪性肝?。?/p>

2、nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD）模型小鼠中，KCs中Foxo3a的變化以及調節(jié)KCs自噬流并抑制炎癥小體活性的機制。
　　方法：
　　1.梯度濃度的棕櫚酸（palmitic acid,PA）（0，0.16，0.32，0.64mM）以及脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）（100ng/ml）聯合刺激體外的KCs12h:1）蛋白印記法（western blottin

3、g assay,WB）檢測：①自噬相關蛋白如Beclin1和LC3；②NLRP3炎癥小體（nucleotide oligomerization domain(NOD)-like receptor family pyrin domain containing3,NLRP3）相關蛋白如：NLRP3、caspase1和凋亡相關斑點蛋白（apoptosis associated speck-like protein,ASC）；③Foxo3a及上

4、游相關蛋白如：腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate ativated protein kinase,AMPK）、磷脂酰肌醇-3-羥激酶（phosphatidyl inositol3-kinase,PI3K）和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶B（protein serine threonine kinase B,Akt）的表達變化。（2）酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked immuno sorbent ass

5、ay, ELISA）檢測細胞上清白介素1β（interleukin-1β，IL-1β）和IL-18的含量。（3）利用2′7′-二乙酰二氯熒光素（dichlorofluorescein diacetate,DCFH-DA）熒光探針并熒光顯微鏡觀察KCs中活性氧產生的情況。
　　2.（1）分別用Foxo3a過表達質粒（Foxo3a overexpression plasmid,Foxo3a-OE）和Foxo3a-短發(fā)夾RNA質粒（Fo

6、xo3a-short hairpin RNA plasmid,Foxo3a-shRNA）轉染KCs48h后，再利用PA和LPS聯合刺激KCs12h：①WB檢測自噬相關蛋白及NLRP3炎癥小體相關蛋白的表達變化；②ELISA檢測細胞上清IL-1β和IL-18的含量；③透射電鏡觀察 KCs自噬小體的分布情況。（2）mRFP-EGFP-LC3缺陷腺病毒感染KCs48 h后，先利用Foxo3a激動劑Iturin A預處理KCs1h，再利用PA和

7、LPS聯合刺激KCs12h，最后利用熒光顯微鏡觀察LC3標記的自噬小體的分布情況。
　　3.（1）Foxo3a-OE轉染KCs48h后，利用PA和LPS聯合刺激KCs12h，再利用熒光定量聚合酶鏈反應（real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-PCR）檢測Foxo3a轉錄下游靶分子的mRNA表達情況。（2）利用Bim-OE及Bim-shRNA體外轉染KCs48h后，先分

8、別利用Foxo3a抑制劑SC97和激動劑Iturin A預處理KCs1h，再利用PA和LPS聯合刺激KCs12h，檢測:①WB檢測自噬相關蛋白及NLRP3炎癥小體相關蛋白的表達變化；②ELISA檢測細胞上清IL-1β和IL-18的含量。
　　4.24只清潔級小鼠隨機分為3組，即正常飼料組（coarse food diet group,CFD），高脂飼料組（high fat diet,HFD）和高脂飼料聯合Iturin A腹腔注射組

9、（Iturin A），每組8只。3組小鼠均喂養(yǎng)16周后，分別取小鼠的肝臟及外周血：（1）HE染色檢測肝臟脂肪變情況；（2）全自動生化分析儀檢測小鼠肝功能及血脂水平；（3）透射電鏡觀察肝臟組織KCs中的自噬小體分布情況；（4）分離肝組織中KCs，并提取其總RNA和蛋白后：①WB檢測自噬相關蛋白及NLRP3炎癥小體相關蛋白的表達情況；②RT-PCR檢測IL-1β和IL-18的mRNA水平。
　　結果：
　　1. PA聯合LPS刺

10、激體外KCs組與單獨LPS處理KCs組比較：（1）自噬相關蛋白Beclin1表達下降，LC3Ⅱ/Ⅰ的表達比例升高；（2）NLRP3炎癥小體相關分子NLRP3、ASC、caspase1 p10、IL-1β和IL-18的表達水平升高；（3）Foxo3a表達下降，p-Foxo3a、p-Akt和p-PI3K的表達升高，而p-AMPK表達無變化；（4）ROS產生明顯增多。
　　2.（1）KCs過表達Foxo3a后，可明顯促進KCs自噬流，并

11、抑制由PA聯合LPS誘導的NLRP3炎癥小體的激活；（2）KCs沉默Foxo3a后，可進一步抑制KCs自噬流，以及進一步促進由PA聯合LPS誘導的NLRP3炎癥小體的激活。
　　3.（1）KCs過表達Foxo3a后，PA聯合LPS刺激組中只有Bim的mRNA表達明顯低于單獨過表達Foxo3a組；（2）①沉默KCs中的Bim，即使給予Foxo3a激動劑，KCs的自噬流仍然受阻，并促進由PA聯合LPS誘導的NLRP3炎癥小體的激活；②

12、過表達KCs中的Bim，即使給予Foxo3a抑制劑，KCs的自噬仍然順向進行，并抑制由PA聯合LPS誘導的NLRP3炎癥小體的激活。
　　4. Iturin A組小鼠與HFD組小鼠比較：（1）肝組織脂肪變及炎癥反應較輕；（2）肝功能及血脂水平較低；（3）肝組織KCs中的自噬小體分布較多；（4）KCs中Foxo3a與Bim的表達明顯升高，自噬被激活，高脂飲食誘導的NLRP3炎癥小體的活性較低。
　　結論：
　　1.游離脂