轉錄因子FoXO3a異常在慢性粒細胞性白血病細胞中作用機制的研究.pdf

1、背景：慢性粒細胞白血病(Chronic Myelocytic Leukemia，CML)是一種致命性的惡性造血干細胞疾病，發(fā)生源于人9號和22號染色體的易位，導致費城染色體t(9;22)(q34;q11)和融合蛋白P210BCR/ABL的形成。P210BCR/ABL顯示異常增強的酪氨酸激酶活性，過度激活下游Ras、PI3K/Akt等信號通路導致腫瘤的發(fā)生。FoxO蛋白家族作為轉錄因子通過調節(jié)細胞內多種重要基因的表達，而介導細胞周期、DN

2、A損傷修復、凋亡、氧化應激、細胞分化代謝等細胞生理過程，與腫瘤的發(fā)生關系密切。hSHIP(Human SH2-containing inositol-5-phosphatase)屬于肌醇磷酸酯酶家族，含SH2結構域肌醇磷酸酯酶能通過負調控PI3K/Akt信號通路對造血細胞增殖、存活及終末細胞活化起作用。本文主要通過血清剝奪實驗及轉染hSHIP基因入K562細胞，以探討hSHIP基因、PI3K/Akt信號通路對FoxO3a表達含量調節(jié)和細

3、胞定位的改變及可能的機制；并構建特異性干擾FoxO3a的shRNA真核表達載體轉染K562，探究干擾FoxO3a的表達對K562細胞生存及凋亡的影響。
　　 方法：免疫組化法檢測FoxO3a的細胞定位改變；轉化提取含hSHIP基因的pcDNA3.1-GFP-hSHIP真核表達載體，用脂質體法轉染K562細胞。采用熒光顯微鏡觀察轉染效果，半定量RT-PCR法及western blotting檢測FoxO3a、Akt的mRNA及蛋白

4、表達含量及磷酸化變化；合成特異性干擾FoxO3a的shRNA，將其插入pRNA-U6.1/Neo載體，構建pRNA-U6.1/Neo-FoxO3a干擾質粒，用脂質體法轉染K562細胞，western blotting檢測干擾效率。Hoechst33258/PI雙染色法分析細胞凋亡；MTT法檢測細胞生長影響。
　　 結果：免疫組化實驗證明，血清激活PI3K/Akt信號通路可導致FoxO3a蛋白由胞核重定位于胞漿；轉染了hSHIP基

5、因的K562細胞株(K562/hSHIP-GFP)與對照組(K562/GFP)相比，AktmRNA、總Akt蛋白及Akt磷酸化水平明顯下調，FoxO3a蛋白的mRNA及蛋白含量明顯增高；成功構建pRNA-U6.1/Neo-FoxO3a干擾質粒并轉染K562細胞，結果顯示FoxO3amRNA及蛋白的表達含量明顯減少。與對照組相比，Hoechst33258/PI檢測顯示干擾組細胞凋亡明顯減少；MTT法顯示K562細胞生長顯著增加。