轉錄因子GATA2突變和慢性粒細胞白血病急性變機制研究.pdf

1、慢性粒細胞白血病CHRONICMYELOGENOUSLEUKEMIA(CML)是起源于多能造血干細胞的惡性克隆增殖性疾病，慢性粒細胞白血病病程通常分為三個階段，即慢性期(chronicphaseCP)；加速期(acceleratephaseAP)及急變期(blastcrisisBC)。慢性期主要表現(xiàn)為粒系增生，骨髓、外周血和脾臟中大量粒細胞積聚，慢性期持續(xù)大約3-5年左右，慢性粒細胞白血病患者進入加速期，加速期一般持續(xù)4-6個月，加速期

2、原始細胞，不成熟細胞比例增高，最后進入終末期-急變期。急變期骨髓和外周血中原始細胞大量積聚，類似于急性白血病表現(xiàn)。那么慢性粒細胞白血病急性變的潛在機制是什么呢?如果能夠探明其具體機制，就有望將慢性粒細胞白血病阻滯在慢性期，延緩或者切斷其急變，這將會給患者帶來福音。另外對于已經處于急變期的患者，也可以設計一些針對急變機制的靶向新療法以期提高患者生存質量。 鑒于此，慢粒急變機制的研究一直是白血病科研領域研究的熱點。Gilliland

3、等提出了白血病發(fā)病機制的多次打擊學說，他們認為急性白血病的發(fā)生需要至少2個遺傳學事件，其中一個事件為信號轉導分子異常賦予細胞生長增殖優(yōu)勢如FLT3受體突變或BCR/ABL融合蛋白，而另外的分子事件為轉錄因子異常如PML-RARα能夠阻止細胞分化，只有具備這兩類分子事件，急性白血病才會發(fā)生，這個理論也適宜于闡述慢性粒細胞白血病急變機制，慢性期在BCR/ABL伴蛋自酪氨酸激酶活性持續(xù)升高作用下，細胞具有很強的增殖優(yōu)勢，但是急變期主要表現(xiàn)為細

4、胞分化受阻，因此慢性粒細胞白血病急變可能需要其他能夠影響細胞分化的轉錄因子異常分子事件協(xié)同。上海血液學研究所實施了旨在闡明白血病發(fā)病機制，尋找亞型特異基因組異常的“白血病基因組解剖學計劃”。我們對85例慢?；颊吆Y查了一組轉錄因子，發(fā)現(xiàn)9例患者在急變期伴隨有特異性GATA-2突變，其中8例患者急變期出現(xiàn)GATA-2CDS(codingsequence)第1075位堿基T＞G雜合突變，引起相應GATA2蛋白第359位氨基酸從亮氨酸突變?yōu)槔i氨

5、酸(L359V)，另外一例患者急變期出現(xiàn)GATA-2CDS第1021到第1038位18bp堿基缺失，引起GATA2蛋白第341位至第346位氨基酸的缺失(Δ341-346)。有趣的是伴GATA2突變的9例患者均向粒/單核系細胞急性變。 第一部分：對GATA2的這兩種突變蛋白做了相應的功能研究。PU.1和CEBPα是調控造血干細胞向髓系細胞分化的兩種重要的轉錄因子，其中PU.1主要調控單核細胞及粒細胞分化，CEBPα主要調控粒細胞

6、的分化。PU.1缺失的小鼠能發(fā)生急性白血病，而CEBPα缺失的小鼠表現(xiàn)為粒細胞成熟障礙。另外，PU.1和CEBPα突變與急性白血病發(fā)生也有很大關系。M2b患者AML-ETO能夠下調CEBPα表達，還能抑制PU.1的轉錄活性，這可能都和白血病發(fā)病相關。因此，我們著眼于探索GATA2突變體的功能，以及其與PU.1和CEBPα的關系，從而對GATA-2突變在慢粒急變中的作用做初步探討。通過免疫共沉淀實驗，體外GST拉下實驗以及螢光素酶激活抑制

7、實驗，我們證實GATA-2L359V和Δ341-346兩種突變蛋白不喪失與PU.1蛋白的結合；與野生型GATA-2相比較，L359V與PU.1在體外結合能力更強；與野生型相比較，GATA2L359V和△341-346能更強抑制PU.1的轉錄活性，顯示GATA2突變是功能獲得性突變(gainoffunction)。但對于CEBPα的轉錄活性抑制，GATA2wt，L359V和△341-346無明顯差異。而PU.1轉錄活性減低能引起下游造血細

8、胞分化相關靶基因表達異常從而引起細胞分化受阻，這可能部分地解釋了伴有GATA2突變CML急性演進的潛在機制。 第二部分和第三部分：在動物模型上，進一步證實GATA2突變在慢性粒細胞白血病急性變中的作用。采用逆轉錄病毒技術，結合小鼠造血干細胞移植技術，使GATA2突變蛋白和BCR-ABL融合蛋白協(xié)同誘導小鼠發(fā)生急性白血病樣疾病。成功地建立了逆轉錄病毒技術平臺。包裝出高滴度的病毒顆粒，在國內首次成功地用BCR-ABL融合基因誘導小鼠

9、發(fā)生了CML樣疾病。而GATA2突變協(xié)同BCR-ABL，組小鼠移植后造血和免疫成功重建，但是GFP陽性細胞比例從2周時的10％左右逐漸下降至零，也就意味著目的基因的表達也呈逐漸下降趨勢，因此未能誘導出預期的AML樣表型。提示GATA2過表達可能對造血干細胞有一定毒性作用，影響造血干細胞自我更新能力，從而使目的基因不能夠在造血細胞內持續(xù)表達發(fā)揮作用。這與GATA2過表達能影響造血干細胞增殖和分化的相關文獻報道結果相一致?？赡苄枰M一步借助