FoxO3a轉(zhuǎn)錄因子對(duì)慢性粒細(xì)胞白血病K562細(xì)胞增殖、凋亡與誘導(dǎo)分化作用的研究.pdf

1、慢性粒細(xì)胞白血病一旦發(fā)展至急變期,預(yù)后極差,目前的各種治療方法均不能有效控制其病情進(jìn)展,多在數(shù)月內(nèi)死亡,因而加強(qiáng)對(duì)急變期的研究具有很重要的科學(xué)及臨床意義。急變發(fā)生機(jī)制中,BCR-ABL融合基因大量表達(dá)、繼發(fā)性多種基因突變以及凋亡受阻、耐藥等機(jī)制逐漸已經(jīng)被闡明,但有關(guān)分化障礙的機(jī)制研究很少且不明確[1;2]。分化障礙往往與信號(hào)通路中的轉(zhuǎn)錄因子異常有關(guān),FoxO3a是FOX轉(zhuǎn)錄因子家族是一個(gè)重要成員,是BCR-ABL/PI3K/AKT信號(hào)通

2、路的下游因子,而其在慢粒急變中的功能失活,可能在慢性粒細(xì)胞白血病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用,值得進(jìn)一步研究。
　　 目的:研究FoxO3a去磷酸化激活或過(guò)表達(dá)后,對(duì)慢粒急變細(xì)胞K562細(xì)胞株的增殖、凋亡及誘導(dǎo)分化作用,明確FoxO3a是否具有誘導(dǎo)慢粒急變細(xì)胞分化作用,并研究FoxO3a與造血分化調(diào)控因子Tall、BTG1基因的關(guān)系,初步探討FoxO3a對(duì)慢粒分化障礙的機(jī)制,有利于從分化障礙角度進(jìn)一步明確慢粒急變的機(jī)理,并為慢粒急變

3、提供一個(gè)新的誘導(dǎo)分化治療方法和靶點(diǎn)。
　　 方法:采用基因重組技術(shù)從人單核細(xì)胞中提取。RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,以其為模板,使用含有酶切位點(diǎn)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,回收PCR產(chǎn)物,對(duì)pIERS2-EGFP和PCR回收產(chǎn)物進(jìn)行酶切、純化、連接,并轉(zhuǎn)化和篩選抗性細(xì)菌克隆,提取質(zhì)粒,進(jìn)行酶切、測(cè)序鑒定,獲得pIERS2-EGFP-FoxO3a質(zhì)粒。通過(guò)非脂質(zhì)體Fu GenE HD轉(zhuǎn)染試劑將pIERS2-EGFP-FoxO3a質(zhì)粒轉(zhuǎn)染K56

4、2細(xì)胞。以PCR、Western-blot檢測(cè)FoxO3a基因的表達(dá)效果。增強(qiáng)FoxO3a在K562細(xì)胞中的表達(dá)后,通過(guò)CellTiter-Blue Cell viabilityAssay檢測(cè)K562細(xì)胞的活性變化;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期時(shí)相分布、細(xì)胞凋亡;Western-blot檢測(cè)p27kip1、Bim基因的表達(dá)變化;采用聯(lián)苯胺染色檢測(cè)K562細(xì)胞聯(lián)苯胺陽(yáng)性率、流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞檢測(cè)表面抗原GPA、CD11b的表達(dá)變化;通過(guò)PCR、We

5、stern-blot檢測(cè)分化相關(guān)基因Tall、BTG1的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果:成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pIERS2-EGFP-FoxO3a,經(jīng)過(guò)酶切和測(cè)序鑒定與預(yù)期目的一致。非脂質(zhì)體Fu GenE HD轉(zhuǎn)染試劑介導(dǎo)K562細(xì)胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pIERS2-EGFP-FoxO3a,應(yīng)用PCR、Western-blot鑒定證實(shí)目的蛋白FoxO3a,在K562表達(dá)。轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pIERS2-EGFP-FoxO3a組與其它對(duì)照組相比,Cell-tit

6、erblue結(jié)果顯示細(xì)胞增殖能力減弱(p＜0.05);流式細(xì)胞術(shù)顯示細(xì)胞阻滯在G0/G1期,并伴隨著p27kip1表達(dá)升,細(xì)胞調(diào)亡比例增加且伴隨著B(niǎo)im的表達(dá)升高,提示FoxO3a可上調(diào)Bim基因的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。增加K562細(xì)胞中FoxO3a基因的表達(dá)后,聯(lián)苯胺染色陽(yáng)性率升高,細(xì)胞形態(tài)學(xué)趨向于成熟方向分化改變,細(xì)胞表面GPA抗原表達(dá)升高,髓系細(xì)胞表面分化抗原CD11b較對(duì)照組及空白對(duì)照組升高,但不如GPA抗原變化明顯，同時(shí)伴隨著T